Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, enfekte farelerin havayollarındaki influenza viral titrelerini verimli bir şekilde nicelendirmektir. Fareler, enfeksiyondan sonra seçilen zaman noktalarında önce intranazal olarak influenza virüsü ile inoküle edilir.

M'ler sakrifiye edilir ve bronkoalveoler lavaj veya BAL sıvısı toplanır. Ardından, BAL sıvısı MDCK hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Enfekte olan hücreler, daha sonra spesifik primer antikorlar ve ardından kızılötesi konjuge ikincil antikorlar kullanılarak viral proteinlerin varlığına göre boyanabilir.

Kızılötesi sinyaller Lycor Odyssey tarayıcı kullanılarak okunur ve viral titrelerin belirlenmesi için Odyssey yazılımı kullanılabilir. Bir standart eğri kullanılarak, viral titrelerin kantitatif tayini gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları; viral titrelerin hassas şekilde nicelendirilmesi, tekrarlanabilirliği ve bu analizi gerçekleştirmek için gereken hacmin küçük olmasıdır.

Bu tekniğin uygulamaları, bu prosedürün ardından klinik örneklerdeki viral titrelere miktar belirlemek için kullanılabildiği için çeşitli solunum yolu viral hastalıklarının teşhis ve tedavisine genişletilebilir. Viral kopya sayısı gibi ek soruları yanıtlamak için qPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniği uygularken, bu geliştirmeden sonra titrel standart kontrol virüsünü kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu teknik, viral lojik alanındaki araştırmacıların klinik örneklerde virüs titresini araştırmasına veya viral proteinleri twist boyama yöntemiyle incelemesine olanak sağlar. Teknikte uzmanlaşıldıktan sonra uygulama 17 saat içinde tamamlanabilir. İşlemleleyle, farelere intranazal yolla 30 µL steril PBS içinde 5.000 plak oluşturan birim (PFU) PR eight influenza virüsü veya negatif kontrol olarak sadece PBS şeklinde enfeksiyon uygulanır. Ötanazi uygulanmış hayvanlardan BAL sıvısı toplamak için öncelikle toraks boşluğu açılır ve ince steril makasla trakeayı açığa çıkarmak için trakeaya paralel bir santimetrelik bir kesi yapılır.

Trakeada küçük bir insizyon yapın, trakeaya %1 BSA içeren PBS'den 0,5 mililitre infüze edin ve lavaj sıvısını nazikçe aspire ederek dışarı alın. Lavaj sıvılarındaki viral titrelere miktar belirlemek için BAL sıvılarını -20 °C'de saklayın. İlk olarak, 5 milyon MDCK hücresini 20 mililitre tam RPMI içeren bir T 75 flask içinde 37 °C'de gece boyunca kültürleyin; ertesi gün hücreleri hasat edin ve optik düz tabanlı siyah 96 kuyucuklu plakaya her kuyucukta 10.000 hücre olacak şekilde ekleyin.

Ardından, inkübasyonun ardından plak gece boyunca 37 °C'de inkübe edilir. Süpernatant nazikçe aspire edilir ve hücreler, FBS yerine %0,2 BSA içeren serumsuz ancak tam DMEM ile iki kez yıkanır. Hücreler yıkandıktan sonra, her kuyuya 50 µL BAL sıvısı veya bilinen konsantrasyonda virüs içeren 50 µL süspansiyon eklenir.

Ardından, viral tutunmayı, girişi ve replikasyonu artırmak için kuyucuk başına, 0,2 micrograms per milliliter konsantrasyonunda TPCK ile işlenmiş tripsin içeren DMEM besiyerinden 50 microliters ekleyin. Virüsün absorbe olması için hücreleri 37 degrees centigrade'de bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, her kuyucuğa komplet RPMI içeren 100 microliters FBS ekleyin ve enfeksiyonun yayılmasına izin vermek için hücreleri gece boyunca kültüre edin; gece boyunca süren inkübasyonu takip edin.

Hücreleri 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın. Hücreler yıkandıktan sonra, hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 100 µL %1 paraformaldehit ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkube edin. Ardından, kuyucuk başına 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın ve bloklama için hücreleri 30 dakika daha inkube edin. Hücreler bloklandıktan sonra, kuyucuk başına 1/1000 oranında seyreltilmiş 50 µL primer antiviral M2 antikoru ekleyin ve mevcut viral proteinleri boyamak için plakaları oda sıcaklığında bir saat inkube edin. İnkübasyon sonrası hücreleri %1 B-S-A-P-B-S ile üç kez yıkayın ve 1/200 oranında seyreltilmiş kuyucuk başına 100 µL kızılötesi boya konjuge ikincil antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkube edin. Hücreler boyandıktan sonra, daha önce yapıldığı gibi onları üç kez yıkayın.

Ardından plakaları, Licor Odyssey kızılötesi tarayıcının okuma cam platformuna yerleştirin. Licor Odyssey yazılımını kullanarak okuyucuda 96 kuyucuklu plaka ayarını seçin. Boş negatif kontrol kuyucuklarını belirleyin ve ardından tüm plakanın floresansını miktarlandırın.

Bir test kuyusunun ortasındaki ilgi bölgesini veya ROI'yi çizmek için otomatik şekil aracını kullanın. Analiz için temel floresan değerini belirlemek amacıyla, negatif kontrolden gelen bir kuyuktaki ROI'yi kullanın; ardından kuyuk boyunca floresan yoğunluğunu ölçmek için Odyssey yazılımı tarafından sağlanan iki karşıt artı göstergeyi ROI içine yerleştirin.

Ardından, tespit için 780 nanometre kanalı ve referans dalga boyu olarak 680 nanometre kullanılarak plakayı tarayın. Okuma komutu etkinleştirildiğinde, ROI'nin düzenli aralıklarındaki floresan yoğunlukları ölçülecektir. Daha sonra toplanan veri noktaları entegre edilecektir.

Standart sapma çarpanı, ROI'ye dahil edilecek baz çizgisi üzerindeki sinyal seviyesini belirleyecektir; hesaplamalar için lütfen entegre yoğunluk seçeneğini seçtiğinizden emin olun, çünkü bu seçenek, boyuttan bağımsız olarak tanımlanan alanlar için net piksel hacmini temsil eder. Arkaplan floresansı, yalancı enfekte kontrollerden miktarla belirlenecek ve test kuyucuklarındaki entegre yoğunluğu tahmin etmek için kullanılacaktır. Titre edilmiş virüsün seri dilüsyonlarını içeren çift kuyucuklardan elde edilen kızılötesi floresans, bir standart eğri oluşturmak için kullanılır.

Standart eğri daha sonra enfekte farelerden alınan BAL sıvısının titrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu deneyde, ikinci ve dördüncü günlerde viral yükte anlamlı bir artış gözlemlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, enfeksiyon sonrası virüs 10. güne kadar temizlenmiştir.

Bu analiz kullanılarak ölçülen viral titreler, enfeksiyon sonrası fare ağırlık kaybı ile iyi bir korelasyon göstermektedir. Bu teknik insan örneklerine de uygulanabilir. Burada, bir insan burun sürüntüsünden alınan H1N1 virüsünün kantifikasyonu gösterilmiştir.

Buradaki saptama sınırı 10³ TCID veya doku kültürü enfektif dozudur. Bu videoyu izledikten sonra, kızılötesi boya tabanlı analiz kullanarak influenza virüs titresinin nasıl tahmin edileceği konusunda da iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır; çünkü Core Imager kullanımı zor olabilir ve bu anlatım, 96 veya 384 kuyucuklu plakalarda viral titrelerin miktarını belirleme yöntemlerimizi basitleştirmeye ve göstermeye yardımcı olacaktır.

Ve son olarak, virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.