Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü

Bu prosedür, klinik veya laboratuvar kaynaklı plasmodium false parem izolatlarının trombosit aracılı kümelenme analizlerini gerçekleştirmek için bazı standartlaştırılmış kılavuzlar sunmaktadır. İlk olarak, enfekte bir hastadan kan toplayın ve santrifüjasyon yoluyla parazitli eritrositleri elde edin, ardından aseksüel olgun evreleri kültüre edin ve saflaştırın. Daha sonra, santrifüjasyon yoluyla trombosit zengin plazmayı hazırlamak ve standartlaştırmak için sağlıklı bir donörden kan toplayın.

Kümeleşme analizi için trombositleri ve parazitli eritrositleri birleştirin. İmmünofloresan mikroskopi sonuçlarının, trombositler tarafından aracılık edilen P. falciparum kümelerini gösterebileceği söylenebilir. Bu teknik, özellikle Plasmodium spp. kümeleşme fenotipini ölçmek için tasarlanmıştır.

Kaynakların kısıtlı olduğu bir ortamdaki klinik izolatlar. Prosedürlerdeki minimum varyasyonların, saha koşullarında kümeleme asidi (clumping acid) sonucunu etkilediği bildirilmiştir. Bu nedenle, malaria endemik saha bölgelerinde standardizasyon sağlamak amacıyla, düşük kaynaklı ortamlara uyarlanmış, açık ve takip etmesi kolay bir protokole ihtiyaç duyulmuştur. Sodyum sitratlı bir vacutainer'a, malaria ile karşılaşmamış bir konaktan yaklaşık beş mililitre tam kan veya CM veya SM malaria hastalarından 2,5 mililitre kan toplayın.

Tam kanı, oda sıcaklığında 250 Gs ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, bulanık süpernatantı dikkatlice temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trombositlerin sıcaklık değişimleri ve fiziksel şoklar nedeniyle kolayca aktive olabileceğini unutmayın.

PRP süspansiyonunu Neubauer hemositometre kullanarak sayın ve istenen konsantrasyonu ayarlamak için PBS ekleyin; ardından 1500 g'de 10 dakika santrifüj ederek PRP fraksiyonunun bir kısmındaki trombositlerin çoğunluğunu çöktürerek trombosit fakir plazma (PPP) peleti elde edin. PRP ve PPP fraksiyonlarını 4 °C'de 8 ila 10 güne kadar saklayın. Topaklanma analizi için ideal olarak taze trombositler kullanın.

Çökeltilmiş periferik kırmızı kan hücrelerini, bir kültür flaskında beş ila 10 mililitre RPMI 1640 ile üç kez yıkayın. %5 hematokrit değerine ulaşmak için PRBC'leri standart sıtma kültür ortamı ve taze enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ile takviye edin. Kültür flasklarını %92,5 nitrojen, %2,5 oksijen ve %5 karbondioksit karışımına tabi tutun. Ardından, hastadan alınan pbcs'lerdeki olgun parazitler için flaskları mühürleyerek kültüre alın.

Kültür flaskını, 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde %5 karbondioksit ortamında 24 ila 36 saat inkübe edin. Düz bir yüzey üzerine yerleştirilmiş buzlu cam lametin bir ucuna yaklaşık 10 ila 15 µL kan koyun. İkinci bir lameti 45 derecelik bir açıyla tutarak, kan damlasına lametin kenarıyla dokunun ve kanın ikinci lametin kenarına eşit şekilde yayılmasını sağlayın.

İlk lama çok fazla basınç uygulamadan, hızlı ancak nazikçe kanı lam üzerine eşit şekilde yayın. Ardından, kanın ince tabakasını havada kurutun ve örnek alanını 10 saniye boyunca metanol ileydehidre edin. Sonrasında tekrar havada kurutun ve örneği %2'lik keem içine daldırın.

En az 10 dakika boyunca bekletin. Su tamamen berraklaşana kadar iyice durulayın ve havada kurutun. Numuneleri, bir ışık mikroskobunda 100 x yağ emülsiyon objektifi altında inceleyin.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde olgun PFS parum, PRBC'leri saflaştırın ve senkronize edin. Kültürün tamamını temiz, steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 370 GS'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün.

Şimdi, pellet'i rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından hücreleri, toplam hacmin yarısı jello fusing olacak şekilde yeniden süspanse edin. İkinci yarının üçte biri proteinsiz ortam ve üçte ikisi pbcs olmalıdır.

Süspansiyonu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve üst ile alt seviyeler arasında net bir ayrım oluşana kadar 37 degrees Celsius sıcaklığındaki bir inkübatörde 15 ila 20 dakika inkübe edin. Üst tabakayı dikkatlice yeni, steril bir 15 mililitrelik tüpe aktarın, 10 mililitre taze RPMI ekleyin ve 370 ila 430 GS hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.

Şimdi, ince kan yayması ile parazit ve gelişim evresini değerlendirin ve daha önce açıklandığı gibi ışık mikroskobu altında inceleyin. Plazma jel flotasyonundan sonra elde edilen P RBC süspansiyonunu, yeni bir 1,5 mililitrelik tüp içerisinde mikrolitre başına 1 × 10⁸ P RBC olacak şekilde ayarlayın. Pbcleri %5 hematokrit, final konsantrasyonu 20 µg/mL olan acridine orange veya ethidium bromide ve toplam hacmin %10'u oranında PRP ile süspanse ederiz.

Benzer şekilde, trombositlerin PBC kümelenmesindeki rolünü belirlemek için enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ve PRP ile PPP içeren PRBC kontrollerini hazırlayın. Şimdi süspansiyonu iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. Küme oluşumunu kontrol etmek için, tüpü oda sıcaklığında 10 ila 12 RRP hızında yuvarlayarak hafifçe karıştırın ve toplam 120 dakika boyunca 15 ila 20 dakikalık aralıklarla örnekleme yapın.

Örnekten 10 µL'yi bir lam üzerine pipetleyin ve floresan altında incelemek için bir lamel ile kapatın. Üç veya daha fazla enfekte eritrositten oluşan kümeler agregat olarak kabul edilir. Bu deney, plazma jel flotasyonu ile zenginleştirme sonrası p FAL'lerin olgun evrelerinin yaklaşık %70'ini analiz etmiştir; agregatlar, normal ışık altında olduğu gibi mikroskop altında kolayca fark edilir. Bunlar hücre agregatları şeklinde, floresan altında ise yeşil veya kırmızı lekeler olarak görünürler.

Sırasıyla akridin oranj veya etidyum bromür boyalarıyla boyandığında, 120 dakikalık inkübasyon sonrası kümelerin boyutu kümeler başına ortalama 15 pbc'den daha fazla olacak şekilde önemli ölçüde artar ve bazı kümeler, görsel olarak sayılamayacak kadar çok pbc içerir. Kümelenme fenotipinin sıklığı, duble denemelerde sayılan her 1000 enfekte hücreye karşılık kümeler içinde bulunan enfekte hücre sayısı olarak hesaplanır.

Bu videoyu izledikten sonra, plasmodium falciparum trombosit aracılı kümelenme analizinin nasıl gerçekleştirileceğine dair net bir anlayışa sahip olmalısınız. Trombositleri ani hareketlerle ve sıcaklık değişimleriyle aktive etmemeye dikkat edin. Bu analiz, ağır sıtmadaki trombosit aracılı kümelenme analizini ölçmek için de uygulanabilir.