Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans

Bu prosedürün genel amacı, CL gangliyonlarında akson rejenerasyonunu incelemek için bir lazer ablasyon sisteminin nasıl kurulacağını ve hizalanacağını göstermektir. Bu işlem; öncelikle bir lazer bezi Thompson polarizörü, yarım dalga plakası, yönlendirme aynası, periskop rayı ve ray aynasının bir optik masaya monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, lazer ışınının mikroskop kondansatör lensinden çıkan ışınla hizalanmasıdır.

Ardından, lazer ışınını merkezlemek ve sıfır ıraksama sağlamak için lazer ışını genişletici lens monte edilir, hizalanır ve konumlandırılır. Prosedürün son adımı, hassas ayarlamalar yaparak lazer ablasyon noktasını görüntü odağıyla çakışır hale getirmektir. Nihayetinde, kusurlu XY NC hizalaması durumunda bile, difraksiyon limitli lazer ışını kullanılarak kollateral doku hasarı minimum düzeyde tutularak yarım mikronluk aksonların hassas bir şekilde kesilmesi mümkündür.

Bu tekniğin Femtosaniye lazerler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 15.000 ile nispeten ucuz olmasıdır. Bakım gereksinimi oldukça düşüktür ve çok hassas akson kesimi sağlar. Bu yöntem, C. elegans akson rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabildiği gibi; sinekler, zebra balığı, fare, periferik sinir sistemi ve in vitro hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Temelde yüzeyin 30 ila 50 mikrometre yakınındaki her hücre. Bileşenler breadboard üzerine yerleştirilmiş haldeyken işe başlayın; lazer periskop direğini ve yükseltilmiş ray desteklerini cıvatalarla sabitleyin. Bu sistem, gözlerinize kolayca zarar verebilecek Sınıf 3B bir lazer kullanmaktadır, bu nedenle lütfen lazer güvenliği kurallarını ciddiye alın.

Serbest ışınlı lazerlerle güvenli çalışma yöntemleri hakkında yerel fizik bölümünüzden birine danışın. Hizalama işlemi boyunca lazeri her zaman en düşük güçte tutun. Okülerlerden bakarken, lazerin mekanik olarak kapatıldığından ve lazerin kapalı olduğundan emin olun.

Şimdi, mikroskobu öncelikle konumlandırın ve ray ekseniyle hizalayın. İkinci olarak, mikroskop kondansatör lensinden gelen iletim ışık demetiyle hizalayın. Üçüncü olarak, raya sabitlenmiş ayarlanabilir bir diyafram veya lens kullanarak rayın her iki ucunu kondansatör demetiyle hizalayın.

İşleme devam etmeden önce ray yüksekliğini ayarlamak için bir terazi ve laboratuvar krikoları kullanın. Rayın her iki ucunun da hizalı olduğundan emin olun. Şimdi, lazer ışınının gland, Thompson polarizörü ve yarım dalga plakası üzerinden geçtiğinden ve döndürme sırasında bunların kenarlarına çarpmadığından emin olun.

Yarı geçirgen plaka, tüm bileşenler ekmek tahtasına sabitlenmiş haldeyken lazerin gücünü ayarlayacaktır. Lazeri açın, darbe frekansını 100 sürekli moduna ayarlayın ve yarı geçirgen plakayı kullanarak gücü minimuma indirin. Lazer ışınını görselleştirmek için bir yapışkanlı not kağıdı veya lens kağıdı kullanın.

Şimdi lazer ışınını ekmek tahtasından (breadboard) yukarı çıkaralım. Işını, yükseltilmiş rayın ucuna monte edilmiş aynaya ulaştırmak için lazerden başlayarak kinematik montajlı aynaları sırasıyla ayarlayın ve sabitleyin. İşlem tamamlandığında, lazer ışını aynaların yaklaşık olarak merkezine hizalanmış olmalı ve lazer ışını mikroskobun iletilen ışık ışını ile hizalanmadan önce aynalar, lazer ışını eksenine yaklaşık 45 derece açıyla yönlendirilmiş olmalıdır.

Ara modüldeki tüm ND filtrelerini ve diyaframları kaldırın veya açın. Şimdi, aşırı yan hasar vermeden aksonların hassas bir şekilde kesilmesini sağlamak için en kritik adıma başlıyoruz. En küçük ablasyon noktasını elde etmek için lazeri, en düşük lazer gücünde x, y ve Z eksenlerinde hassas bir şekilde hizalayacağız.

Lazer ve iletilen ışık demetleri, bir kağıt üzerinde eş zamanlı olarak görülebilir. Başlamak için kağıdı mikroskop portunun yakınına yerleştirin. Şimdi periskobun üzerindeki aynada ve rayın ucundaki aynada bulunan kaba ayarları kullanarak lazeri hizalamaya başlayın.

Hizalanmış kondansatör merceği ile açık objektif taretinin arasına bir kâğıt yerleştirin. Lazer ışınını, daha geniş olan iletilen ışık ışınının merkezine hizalamak için ray aynasındaki hassas ayarları kullanmaya devam edin. Şimdi, mikroskobu klemplerle yerine sabitleyin.

Lazer hizalamasının değerlendirilmesine ilişkin ek adımlar yazılı makalede bulunabilir. 300 mikronluk lazer ışınını, 10 milimetrelik objektifin arka açıklığını dolduracak şekilde 33 kat genişletmek için çift galilean ışın genişleticiler kurulmalıdır. İşleme, dört lensi taşıyıcılara monte ederek başlayın.

Ardından, tüm lensler aynı optik eksende ve lazer ışınına tam dik olacak şekilde ray üzerine sabitleyin. Lazeri açın ve minimum güç ile sürekli moda ayarlayın. Her bir lensteki ışın hizalamasını yaklaşık olarak ayarlayın.

Işını görmek için kağıt kullanın. Şimdi lazeri kapatın. Lazere bir güvenlik kapağı takın ve mikroskobu lazer ışınının yolundan kaldırın.

Lazeri tekrar açın ve yakın bir duvardaki görüntüsünü inceleyin. Işını genişletmek için lenslerin ince ayarını kullanın. Ardından, ışını objektif arka açıklığının tahmini konumunda tekdüze parlaklıkta bir daire şeklinde hizalamak için kinematik montajlı son iki aynayı ayarlayın.

Işının boyutunu ve düzenliliğini kağıt üzerinde gözlemleyin. Ardından, kağıt lensten uzaklaştırıldıkça ışın boyutunun nasıl değiştiğini takip ederek ışını sıfır yakınsamaya ayarlayın. Lazeri kapatın ve mekanik kepengi kapatın.

Doğru hizalamayı belirlemek için sabit klempleri kullanarak mikroskobu tekrar lazer ışını yoluna sürün. Klempleri mikroskobun boş olan tarafına yerleştirin ancak onları tamamen sıkmayın. Şimdi lazeri açın.

Güvenlik panjurunu kaldırın ve objektif taretini açık konuma getirin; sahne üzerinde bir kâğıt kullanarak, kondansatörden gelen iletilen ışık demetinin merkezinde, genişletilmiş ve tekdüze lazer demeti görünür olmalıdır. Eğer merkezlenmemişse, mikroskop kelepçelerini gevşeterek ve mikroskobu dikkatlice hareket ettirerek demetleri merkezleyin. Şimdi güvenlik panjurunu kapatın ve lazeri tetikleme moduna ayarlayın.

60x objektifi olduğu yerde döndürün. Şimdi hedef lam üzerindeki yüzey çiziklerini görüntüleyin. Güvenlik kepenklerini kaldırın, ablasyon lazerini tetikleyin ve lazer gücünü minimum ablasyon noktası için ayarlayın.

Leke dairesel olmalı ve görüntü merkezinin 5 ila 10 mikronu içinde, yani ablasyon lekesinin merkezinde bulunmalıdır. Lekenin merkezde kalmasını ve ışın profilinin homojen olmasını sağlamak için kinematik montajlı ray aynasının hassas ayarları kullanılarak, ray montajlı aynanın ve üst periskop aynasının iteratif olarak ayarlanması gerekecektir. Odak noktasını bir mikronluk adımlarla sistematik olarak yukarı ve aşağı hareket ettirerek ve her adımda ablasyon lazerini tetikleyerek lazerin Z odağını değerlendirin.

Işın doğru şekilde genişletilmiş, hizalanmış ve konverjans ayarları doğru yapılmışsa, görüntü odağında maksimum ablasyon yapmalı; odağın bir mikron üzerinde veya altında ise zayıf ablasyon yapmalı veya hiç yapmamalıdır. Maksimum ablasyon noktası görüntü odağının üzerinde veya altındaysa, lazer ablasyonu görüntü odağıyla örtüşene kadar Galilean teleskobun L3 merceğini hareket ettirerek genişletilmiş ışının Z odağında son ayarlamaları yapın. Nematodlar özelleştirilmiş bir lam üzerine monte edilmiş ve aksonlar kurulan sistem kullanılarak ablate edilmiştir; Lazer eksosomisi ve akson rejenerasyonunun time-lapse görüntülemesi oldukça başarılı olmuştur.

Motorize bir tabla kullanılarak, tek bir lam üzerinde beş farklı hayvandan beş aksonun rutin ve hassas bir şekilde kesilmesi ve görüntülenmesi mümkün olmuştur. Aksonların görüntüleme süresi sınırlayıcı faktördü.

Deneylerin yaklaşık %10'u yüksek kaliteli time-lapse videolar üretmiştir. Geriye kalan deneylerin tamamı iyi veriler sağlamış, ancak genellikle beş ila sekiz saatlik immobilizasyondan sonra başlayan küçük titreme hareketleri nedeniyle estetik açıdan daha az etkileyici olmuştur. Bu prosedür uygulanırken, lazerin x, y ve Z eksenindeki hizalamasını doğru bir şekilde değerlendirmek her zaman önemlidir.

İnsanların akson kesmeye çalışırken karşılaştıkları en yaygın sorun, kollateral hasardır veya aksonların tamamen kesilememesidir ve bu durum neredeyse her zaman yanlış hizalanmış bir lazerden kaynaklanır. Bu lazer ablasyon sistemi ve c Agains'te akson rejenerasyonunu görselleştirme tekniği, herhangi bir genetik mutasyonun akson rejenerasyonu üzerindeki etkisini rutin olarak analiz etmenize olanak sağlayacaktır. NCL Agains.