Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Bu protokol, kök hücrelerin kitosan mikrokürelerden kolajen jel iskeletine aktarılması, hasat edilmesi ve kültüre edilmesi için in vitro bir strateji sunmaktadır. Birincil adiposit kök hücreler daha sonra emülsifiye edilir ve kitosan mikroküre hazırlığı geri kazanılır. Ardından, kök hücreler kitosan mikrokürelerin üzerine ekilir ve CS yüklü CSM üretmek için sekiz mikron gözenek boyutuna sahip bir membran kültür plakası insertinde kültüre edilir; son olarak mikroküre iletim sistemi üç boyutlu bir kolajen jel iskeletle karıştırılır.

Nihayetinde, bu CSM sistemi rejeneratif tıp ve ilaç iletiminde kullanım potansiyeli sunmaktadır. Bu tekniğin hücre enjeksiyonu veya mikroenkapsülasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin bir taşıyıcı malzemeye tutunabilmesi ve ilk uygulamadan sonra varlığını sürdürebilmesidir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler, esan mikrokürelerin doğal bir statik yüke sahip olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Hücreleri, onları rahatsız etmeden bir mikroküre yatağı üzerine yüklemek zorlayıcı olacaktır. Perineal ve epidermal adipoz dokuları çıkarıp yıkayın ve dokuyu ince parçalara ayırın, ardından bir ila iki gramı %1 FBS içeren 25 mililitre HBSS içine aktarın. Santrifüjden sonra, serbest yüzen adipoz doku tabakasını 125 mililitrelik bir erlenmeyer flaskına toplayın.

25 mililitre tip iki kollajenaz ekleyin ve reaksiyonu orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Ardından, yağ ve adipoz tabakanın altındaki sıvı fraksiyonu dikkatlice uzaklaştırın ve sırasıyla 170 mikronluk naylon ağ filtrelerden süzün. 25 mililitre ile iki kez yıkama yaptıktan sonra hücreleri santrifüjle hasat edin.

HBSS Resus aşamasında, peleti 30 mililitre takviyeli mesen pro büyüme ortamında süspanse edin. Saflaştırılmış adipoz kaynaklı kök hücreleri iki adet T 75 kültür flaskına paylaştırın ve ASC preparasyonunu 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde amplifiye edin. Bu CSM protokolü, iyonik koer tekniği kullanan bir su içinde yağ emülsifikasyon sürecidir.

Kararlı bir su ve yağ emülsiyonu elde etmek için, 6 mL'lik kitozan sulu çözeltisini, 100 mL'lik bir yağ fazı karışımı içerisinde, bir saat boyunca eş zamanlı olarak zıt yönlerde çalışan üstten karıştırıcı ve manyetik karıştırıcı kullanarak emülsiye edin; dört saat boyunca her 15 dakikada bir n-oktanol içinde %1'lik potasyum hidroksitin 1,5 mL'sini ekleyin. İyonik çapraz bağlanma reaksiyonu tamamlandıktan sonra, yağ fazını yavaşça süzün ve küreleri derhal 100 mL asetona ekleyin. Yağ fazı tamamen uzaklaşana kadar küreleri asetonla yıkayın.

Ardından, geri kazanılan küreleri vakumda kurutun. Desikatörde kuruttuktan sonra, partikül boyut analizörü kullanarak ortalama CSM partikül boyutunu, miligram başına yüzey alanını ve birim kübik hacmi belirleyin. Kalan tuzları uzaklaştırmak için CSM'yi steril su ile üç kez yıkayın.

Şimdi, hücre deneylerinde kullanmak üzere CSM preparasyonunu mutlak alkol ile sterilize edin; 50 mililitrelik bir cam tüp içinde beş miligram mikro küreciği bir mililitre %0,5 TNBS çözeltisi ile karıştırıp 40 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Ardından üç mililitre 6 N hidroklorik asit ekleyin ve 60 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Numuneler oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, beş mililitre deiyonize su ve 10 mililitre etil eter ekleyin.

Serbest TNBS'yi ekstrakte etmek için, sulu fazdan beş mililitrelik bir alikot alın ve oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, kalıntı eteri uçurmak için bir su banyosunda 15 dakika boyunca 40 °C'ye ısıtın. Bir spektrofotometre ile 15 mililitre su ile seyreltin. Hazırlanan kitosan mikrokürelerin absorbansını, blank olarak TNBS kullanarak 345 nm'de ölçün.

CSM hazırlığı için kullanılan kitosanı da ölçün. Şimdi, CSM'nin serbest amino grup sayısını kitosandaki toplam amino grup sayısına oranlayarak hesaplayın. Sterilize edilmiş beş miligram CSM'yi sterile HBSS içerisinde gece boyunca dengeye getirin.

CSM'yi 24 kuyucuklu kültür plakaları için sekiz mikronluk membran insertine aktarın. CSM çöktükten sonra HBSS'yi dikkatlice aspire edin. Şimdi insertin içine 300 µL büyüme ortamı ve dışına 700 µL büyüme ortamı ekleyin. Resus.

Adipoz kaynaklı kök hücreleri 200 µL büyüme besiyerinde süspande edin ve kültür plağı içindeki CSM üzerine ekleyin. 24 saat boyunca 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. İnsert membranına migrasyon yapmış hücreleri rahatsız etmeden, SC yüklü CSM'yi steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Şimdi artık medyumu uzaklaştırın ve her tüpe 250 µL taze büyüme medyumu ekleyin. 5 mg/mL'lik MTT çözeltisinden 25 µL ekleyin ve dört saat boyunca inkübe edin. Medyumu uzaklaştırın ve formazan kompleksini çözmek için 250 µL dimetil sülfoksit ekleyip vorteksleyin; ardından CSM'yi 2.700 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan absorbansını 630 nanometre referans alarak 570 nanometrede ölçün. Bilinen sayıda canlı A SC'den elde edilen absorbans değerine kıyasla, CSM ile ilişkili hücre sayısını belirleme işlemine geçin. Beş miligram A SC yüklü CSM'yi, sıçanlardan ekstrakte edilmiş 7,5 miligram/mL Tip 1 kolajen ile karıştırın.

Kuyruk tendonunun pH'ını 2N sodyum hidroksit kullanarak 6.8'e ayarlayın ve bir kültür plağına dökün. Fibrillenmesi için yerleştirin ve ardından 12 kuyucuklu bir plağa aktararak 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi boyunca gün aşırı collagen A-S-C-C-S-M jellerinin besiyerini yenilemeye devam edin.

Ayrıca, standart mikroskopi tekniklerini kullanarak hücrelerin CSM'den jele salınımını ve göçünü izleyin. Aşağıdaki örnek, adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kitosan mikrokürelerden kolajen jel iskeleye aktarılmasına yönelik in vitro stratejiyi açıklamaktadır. SEM ve TEM görüntüleri, tek tip boyutta gözenekli CSM hazırlığını göstermektedir.

Mikrokürelerin primer adipoz türevli kök hücrelerle inkübasyonu, miligram başına 4.000 CSM kalsiyum am hücresini göstermektedir. Bir SC'nin boyanması, CSM üzerinde yayılımı ve mikrokürenin gözenekli yarıklarına uzanan filopodları göstermektedir. Hücre yüklü CSM, kolajen jel ile karıştırıldığında, hücreler jelin içine göç eder ve zaman içinde takip edilebilir.

Bu tekniğin doğurguları, hemen geniş çaplı ve kronik doku kaybının tedavisine yönelmektedir. Bununla birlikte, bu tedavi rejimi, farklı seviyelerdeki yumuşak ve kalp dokusu kayıplarını tedavi etmek için kullanılan çeşitli hücreler ve/veya biyomalzemelerle entegre olabilme çok yönlülüğü sayesinde çok daha fazla potansiyele sahiptir. Bu yöntemin konak hücre iletimine dair içgörüler sağlayabileceği düşünülmektedir.

Ayrıca enjekte edilebilir sistemler, terapötik ilaçların iletimi veya hem hücrelerin hem de terapötik ilaçların birlikte iletilmesini sağlayan hibrit sistemlerin geliştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.