Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

Bu deneyin genel amacı, fareyi anestezi altına alıp kafatasını açtıktan sonra, içsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresan sinyalleri veya FAS görüntüleme kullanarak farelerin olfaktor bulb yüzeyindeki kokuyla uyarılan aktiviteleri haritalamaktır. Olfaktor bulb üzerindeki kemik inceltilir. Bir bistüri ucu kullanılarak kemik flebi çizilir ve ardından kaldırılır; dental simanla bir hazne oluşturularak olfaktor bulbun açıkta kalan yüzeyi çevreler.

Aros ile doldurulur ve bu preparasyonun üzerine bir lamel yerleştirilir. Koku haritaları, aynı farede intrinsik optik sinyaller ve FAS görüntüleme kullanılarak ardışık olarak elde edilir. Fare koku soğanındaki diğer uyarılmış aktivitelerin optik yansıma ve otofloresan sinyaller kullanılarak görüntülenmesi, koku soğanındaki kokuların uzamsal dağılımına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, iki-deoksi glikoz görüntüleme veya fMRI gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kokuyla uyarılmış aktivitelerin tek bir glomerül seviyesindeki uzamsal çözünürlükte kaydedilmesini mümkün kılmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemlerle yeni tanışan kişiler, hem cerrahi hem de enstrümantal becerilerin kazanılmasının zaman alması nedeniyle çalışmalarının başında zorluklar yaşayacaklardır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, cerrahi ve görüntüleme prosedürlerinin kritik basamaklarına dikkat çekmek açısından büyük önem taşır. Anestezinin sağlandığını doğrulamak için farenin arka patisini sıkıştırın ve kafa derisindeki tüyleri tıraş makinesi kullanarak temizleyin.

Cilt üzerindeki kalıntı kılları, distile su ile ıslatılmış steril gazlı bezlerle silerek temizleyin. Fareyi, burnu başın arka kısmı ile aynı düzlemde olacak şekilde stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Olfaktör bulbu yatay olarak konumlandırmak için, hareketi önleyecek şekilde kulak ve burun barlarını sıkıca sabitleyin.

Görüntüleme sırasında kurumayı önlemek için gözlere oftalmik pomat uygulayın ve ardından kafa derisi bölgesini steril makas kullanarak Betadine ile dezenfekte edin. Kulakların arkasında, başın arka kısmında bir insizyon yapın, ardından her iki tarafta kulak tabanına doğru ve göz kapakları boyunca ön-arka yönde alna doğru kesin. Burnun üzerindeki deriyi keserek kafa derisinin çıkarılmasını tamamlayın.

Burun barını kılavuz olarak kullanarak hayvanı bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve kafatasının üstündeki periostu nazikçe ayırmak için saline ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Kalan dokuları temizlemek için bir pens kullanın ve olfaktor bulb bölgesinin deney boyunca nemli kalmasını sağlayacak temiz bir hazırlık elde etmek için kafatası yüzeyini bir skalpel ile kazıyın.

Gözlerin arasında yer alan olfaktör bulbusun üzerindeki kemiğin üzerine, distile su ile ıslatılmış emilebilir jelatin sünger bir parça yerleştirin. Jelatin süngeri kaldırın ve 10 numara bistüri ucuyla kemiği nazikçe kazıyarak işleme başlayın. Bistüri ucu ile kemik arasında sabit 45 derecelik bir açı tutun ve bıçağı göz kapaklarından bulbus bölgesinin sagital tarafına doğru hareket ettirin.

İnceltme işlemi sırasında kemik üzerine dikey basınç uygulamamaya veya venöz sinüsün üzerindeki kemiği çizmemeye dikkat edin. Her beş dakikada bir durun ve preparatı soğutmak için kemiğin üzerine nemlendirilmiş bir jelatin sünger yerleştirin. Kemik tozlarını temizlemek için kafatasını süngerle silin ve neşter ucunu temiz ve keskin tutmak için periyodik olarak silin.

Süngerimsi kemik tabakası veya trabekula görünür hale gelene kadar devam edin. Olfaktör bulbun ince damar yapısı görünür olduğunda, kemiği kazımayı durdurun ve dikdörtgen bir alan çizerek olfaktör bulbu çevrelemek için 11 numara skalpel ucu kullanın. Pencereyi venöz sinüslerin sınırları içerisinde tutarak, dikdörtgen alan içindeki kemiği kazımaya devam edin.

Dura yüzeyine temas etmemek için bistüri ucunun derinliği konusunda ekstra dikkatli olun. Kalan kemiğin kalınlığını anlamak için, bir pens ucuyla kemiği nazikçe itin. Kemik baskı altında esnerse, bir sonraki adıma geçin.

Bir damla salin ekleyin ve kemik flebini kaldırmak için skalpelin ucunu yatay olarak yönlendirerek kullanın. Kalan kemiğin yırtılmasını önlemek için flebi pens yardımıyla dikkatlice çıkarın. Olfaktör bulb yüzeyi açığa çıktığında, herhangi bir kanama veya kan damarı olmadığını kontrol edin. Anastomoz.

Alanı, salinle ıslatılmış bir jelatin süngerle silin. Olfaktör bulbu nemli tutmak için, kranial pencerenin etrafındaki kemik üzerinde bir havuz oluşturacak şekilde 29 gauge bir şırınga kullanarak poliakrilat dental siman uygulayın. Dura üzerine düşük erime noktalı arosdan bir damla damlatın ve görüntüleme için kranial pencerenin üzerine steril lamel yerleştirin.

Stereotaksik çerçeveyi, kapillerler görünür hale gelecek şekilde kraniyal pencere görüş alanının merkezine odaklayarak stereo mikroskobun altına yerleştirin. 580 nanometre yeşil ışığa geçin ve görüntüleme sırasında preparatın durumunu kontrol etmek için anatomik bir kontrol görüntüsü kaydedin. Ardından, 630 nanometre aydınlatma altında intrinsik optik sinyal görüntüleme veya 480 nanometre aydınlatma altında flavoprotein otofloresan sinyal görüntüleme yöntemlerinden birini kullanarak stimülasyon denemelerini kaydetmeye geçin. Standart bir görüntüleme oturumu, yalnızca hava verilen 5 ila 10 saniyelik bir bazal çizgiyi ve ardından seçilen koku konsantrasyonuna bağlı olarak 3 ila 10 saniye süren koku stimülasyonunu içerir.

Ve son olarak, bazal toparlanma için 70 ila 82 saniyelik hava iletimi kaydedilir. Burada, olfaktör bulbusun vaskülatürü kraniyal pencere aracılığıyla görüntülenir ve ardından, hem iOS hem de FAS görüntüleme kullanılarak yakalanan, odoran olarak h sinal kullanılan bir stimülasyon denemesinin sonuçları izlenir. iOS görüntüleme kullanıldığında, kokuyla tetiklenen aktivite koyu renkli absorbans alanları olarak gösterilir; AL tarafından aktive edilen alanlar beyaz oklarla belirtilmiştir ve aktif alanlar hem tekil hem de ortalaması alınmış çoklu denemelerde görülebilir.

Aynı farede FAS görüntülemeye geçildiğinde, OD ile uyarılan aktivite artık siyah oklarla belirtilen beyaz otofloresans emisyon alanları olarak görülmektedir ve bu durum hem tekil hem de ortalamaya alınmış çoklu denemelerde gözlemlenebilir. iOS görüntüleme ile görülen siyah absorbsiyon bölgelerinin ve FAS görüntüleme ile görülen beyaz otofloresans emisyon alanlarının birbiriyle örtüştüğüne dikkat edin. Bu uzamsal uyum, iki tekniğin de aynı olfaktör glomerüllerin görselleştirilmesine olanak tanıdığını doğrulamaktadır. Optik yansıma ve otofloresans sinyalleri kullanılarak uyarılan aktivitelerin ana görüntüleme sırası belirlendikten sonra, cerrahi işlem için bir saat ve görüntü elde etme işlemi için birkaç saat yeterli olmaktadır.

Bu optik görüntüleme yöntemlerini kullanmanın temel dezavantajları, serbestçe hareket eden farelerde koku haritalarını görselleştirmek için uygulanamamalarıdır. Ayrıca, fotonların biyolojik dokulara sınırlı penetrasyonu nedeniyle, doksanların sonlarındaki gelişiminden sonra ventral koku glomeruli'ne erişim sağlayamazlar ve koku sistemindeki intrinsik sinyalleri kaydedemezler. Bu durum, optik görüntüleme alanındaki araştırmacıların od'un özel kaplama özelliklerini keşfetmeleri için belki bir yol sunmaktadır.

Koku soğancığında flavoprotein otofloresans görüntüleme, endojen optik sinyalleri kullanarak koku disklerinin özel kaplaması hakkında yeni bakış açıları sunan gelecek vadeden bir tekniktir.