Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Koku epitelinin bir preparatı bir kaba monte edilir ve nemlendirilmiş bir hava akımına yerleştirilir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir referans elektrot, bir tampon çözelti aracılığıyla dokuya elektriksel olarak bağlanır. Bir kayıt elektrodu ise koku epitelinin yüzeyine yerleştirilir.

Olfaktör epitel, nemlendirilmiş bir hava akımı içine verilen ve odorantları olfaktör epitelyuma taşıyan, bilgisayar kontrollü odorant püskürtmeleri ile uyarılır. EOG sinyalleri, bir amplifikatör ve dijitalleştirici aracılığıyla kayıt bilgisayarına iletilir. Merhaba, ben Johns Hopkins Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Hijyen XO Laboratuvarı'ndan Catherine Ciar.

Bugün sizlere farelerden elektro-olfaktogram kaydetme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda koku duyusu duyusal nöronlarının kokulara verdiği yanıtları incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Kayıt düzeneği; bir kayıt elektrodu, referans elektrodu, hava iletim tüpü, numune tablası ve bir Faraday kafesi içindeki hava tablasına sabitlenmiş bir diseksiyon mikroskobundan oluşmaktadır. Elektrotların hava iletim tüpüne yerleştirilmesi için mikro manipülatörler kullanılır. Sürekli bir hava akımı, hava iletim tüpünden ve numunenin üzerinden geçmeden önce nem eklemek amacıyla distile su içinden kabarcıklar halinde geçirilir.

Numune için montaj yüzeyi olarak, altı ila sekiz milimetre kalınlığında bir adaptasyon tabakasıyla doldurulmuş 60 milimetrelik bir kültür kabı kullanılır. Montaj kabındaki bu koruyucu tabakanın içerisine bir kuyu ve bir kanal oyulur. Bu işlem, modifiye edilmiş ringer çözeltisi aracılığıyla referans elektrodun numuneye elektriksel olarak bağlanmasını sağlamak amacıyla yapılır.

Kayıt ve referans elektrotları bir amplifikatöre bağlanır. Amplifikatörden gelen sinyaller bir dijitalleştiriciye ve ardından bir bilgisayara gönderilir. Stimülasyon protokolünü kontrol etmek, sinyali kaydetmek ve yanıtları analiz etmek için XI grafik yazılımı kullanılır.

Kayıt elektrodu yerleştirilirken ve EOG kayıtları sırasında elektriksel potansiyeli gerçek zamanlı olarak izlemek için amplifikatörden sonra bir osiloskop bağlanır. Koku uyaranlarının verilmesi, koku uyaranı verilmeden hemen önce sinyal toplama için kullanılan aynı bilgisayara bağlı olan bir pico spritzer tarafından kontrol edilir.

Piko spritzer çıkışı, sıvı koklayıcı içeren bir koklayıcı şişesine bağlanır. Şişe daha sonra hava iletim tüpüne bağlanır. Şimdi kayıt deneyleri için elektrotların nasıl hazırlanacağına bakalım.

Kayıt elektrodu, modifiye ringer çözeltisi ile doldurulmuş çekilmiş bir cam kapiler içindeki gümüş klorür telidir. Referans elektrodu ise gümüş klorür telidir. Her iki elektrodun hazırlığına, gümüş teli elektrot tutucuya yerleştirerek başlayın.

Kayıt elektrodu için, elektrot tutucusunun ucundan bir ila iki santimetre tel çıkmalıdır. Referans elektrodu için daha fazla tel bırakılabilir. Gümüş klorür kaplamasını eklemek için teli 0.1 molar sodyum klorür içine yerleştirin ve elektrot tutucusunu 1.5 ila dokuz voltluk bir DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın.

Güç kaynağının negatif terminali, 0,1 molar sodyum klorür çözeltisine elektriksel olarak bağlanmalıdır. Kayıt ve referans elektrotlar arasındaki statik yükü eşitlemek için klorür reaksiyonunun 10 dakika boyunca devam etmesini sağlayın. Elektrotları kayıt cihazına yerleştirmeden önce birbirlerine kısa süreliğine dokundurun.

Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak cam bir kapiler çekin. Kapiler ucundaki açıklığın çapı yaklaşık beş ila 10 mikron olmalıdır. Kapilerin küt ucunu çizip kırmak için bir elmas kalem kullanın; böylece kapiler, gümüş telden yaklaşık iki santimetre daha uzun olmalıdır.

Kesilmiş ucu ateşle cilalamak için bir bütan pürmüzü kullanın ve ardından modifiye Ringer çözeltisi içindeki %0,5 agros'u eritin. Isıtılıp çekilerek uzun ve ince bir uç haline getirilmiş bir şırınga yardımıyla, transfer pipeti kullanarak küçük bir miktar erimiş agro çözeltisini elektrodun ucuna çekin. Çekilmiş kılcal boruyu yaklaşık yarıya kadar doldurun.

Modifiye ringer çözeltisi ile kılcal boruyu, hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun. Doldurulmuş elektrodu, kullanılmaya hazır olana kadar tabanında az miktarda modifiye ringer çözeltisi bulunan saklama kavanozunda muhafaza edin. Bir doku örneği hazırlandığında ve kayıt için uygun hale geldiğinde, doldurulmuş kılcal boruyu, elektrotlar hazır durumdayken kayıt elektrodu telinin üzerine yerleştirin.

Kayıt hazırlıklarına başlamak için bir kayıt deneyine göz atalım. Kurban edilen bir farenin kafatasının üzerindeki deriyi çıkarın ve başı orta hat boyunca ikiye bölün; başın bir yarısını medial tarafı yukarı gelecek şekilde montaj tabağına yerleştirin. Turbinatları açığa çıkarmak için septumu dikkatlice çıkarın.

Montajı yapılmış dokunun bulunduğu kabı kayıt aşamasına yerleştirin. Turbinatlar üzerindeki kayıt konumunun mikroskobun altında ortalanacak şekilde aşamayı hizalayın. Şimdi, turbinat yüzeyine dakikada yaklaşık 600 milliliters hızında nemlendirilmiş hava sağlamak için hava tankını açın.

Hava iletim tüpünü, kayıt konumundan yaklaşık 10 milimetre uzaklıkta olacak şekilde konumlandırın. Amplifikatörü DC moduna ayarlayın, çünkü AC amplifikasyonu EOG sinyalinde artefaktlara neden olacaktır. Bir kilohertz değerinde düşük geçiren filtre ve 100 x kazanç ile kayıt yapın.

Şimdi kayıt ve referans elektrotlarını mikro manipülatörlere monte edin. Referans elektrodunu montaj kabındaki kuyucuğun içine indirin ve dokuyla elektriksel olarak bağlantılı olacak şekilde modifiye ringer çözeltisi ile kaplayın. Kayıt elektrodunu dikkatlice turbinate iki B veya üçün yüzeyine indirin.

Elektrot, olfaktör epitelyumun yüzeyine hafifçe değmelidir. Elektrot epitelyumla temas ettiğinde, osiloskopta düz bir temel çizgi belirecektir. Şimdi, bilgisayardaki hava iletim tüpünün yan portuna bir koku şişesi takın.

Bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri toplama için örnekleme hızı iki kilohertz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım, bir koku pulsunu tetikleyecek ve kayda başlayacaktır.

Tipik bir stimülasyon protokolü; 100 milisaniye süreli, tekli pulse eşli, bir saniyelik aralıklarla ayrılmış 100 milisaniyelik pulslar veya on saniyelik sürekli bir pulse şeklinde olabilir. Adaptasyonu minimize etmek için, yüksek koku konsantrasyonları uygulandıktan sonra protokoller arasında bir ila beş dakika bekleyin. Tüpte kalıntı koku kalabilir; ek doku örnekleriyle devam etmeden önce hava tüpünü %95 etanol ile yıkayın ve kurulayın.

Axo graft yazılımı, EOG sinyalinin temel parametrelerini ölçmek için araçlar sağlar. Bu parametreler arasında yanıt genliği, latans, zirveye ulaşma süresi ve sonlanma zaman sabitleri yer alır. EOG'nin yanıt genliği, latans yükselme süresi, zirveye ulaşma süresi ve sonlanma zaman sabiti dahil olmak üzere çeşitli parametreleri, fareler arasındaki normalize edilmiş yanıtların karşılaştırılması için özellikle yararlıdır.

Burada, artan konsantrasyonlardaki sıvı amil asetat stimülasyonuna yanıt olarak bir fareden elde edilen OG'ler gösterilmektedir. Üstteki siyah çizgi, odorant stimülasyonunun zamanlamasını ve süresini belirtmektedir. Burada, beş fareden ortalaması alınmış bir doz-yanıt ilişkisi görülmektedir; hata çubukları %95 güven aralıklarını temsil etmektedir.

Çok yüksek koku konsantrasyonlarında genellikle pik amplitüdünde bir azalma gözlenir. Eşleşmiş pulse stimülasyona yanıt olarak verilen bir EOG örneğinde, tek bir kısa odoran pulse'unun birkaç saniye süren bir adaptasyona yol açtığı görülmektedir. Burada, 10 saniyelik sürekli odoran stimülasyonuna yanıt olarak alınan bir EOG gösterilmiştir.

EOG, sürekli koku sunumu sırasında duyarsızlaşma gösterir. Farelerden elektrot faktör gramının nasıl kaydedileceğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, elektrodun sadece epitelyum yüzeyine yerleştirilmesi gerektiğini ve elektrodun yüzeyin altına nüfuz etmemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Varyasyonu minimize etmek için her zaman başın aynı tarafından kayıt yapın ve kurulumda değişikliklerden kaçının; dokuyu nemli tutun ancak sıvı damlacıkları birikmesine izin vermeyin. Diseksiyondan hemen sonra dokuyu nemlendirilmiş havaya yerleştirmek, dokuyu kayıt için en iyi durumda tutacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.