Bir İskemik Yara Model üretmek için Basitleştirilmiş Tekniği
2 Mayıs 2012
Biz santral arter ve sinir ve beyin nörovasküler demet bölerek bir tavşan kulağı iskemik yara modeli oluşturmak için minimal invaziv bir teknik geliştirdik. Bir subkutan tünel sonra tüm cilt altı dokuları keser. Bu prosedür, minimal deri bozulmasına neden olmakta ve güvenli bir şekilde, diyabetik hayvanlarda kullanılabilir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, sadece normal tavşanlarda değil, aynı zamanda yaşlı veya diyabetik olanlar gibi direnci azalmış tavşanlarda da iskemik yaralar oluşturmayı mümkün kılmaktır. İskemik yara oluşturmak için halihazırda kullanılan tüm teknikler yüksek derecede invazivdir ve şimdiye kadar bu tekniklerin hiçbiri diyabetik hayvanlarda kullanılamamıştır. Bu prosedür, üç vasküler demet üzerinde üç küçük cilt insizyonu yapılmasıyla başlayan minimal invaziv cerrahi kullanmaktadır.
Bir sonraki adım, kulağa giden kan dolaşımının azaltılması ancak tamamen ortadan kaldırılmaması için merkezi venin ve coddle vasküler demetinin izole edilip korunmasıdır. Son olarak, geri kalan damarlar, sinirler ve deri altı dokuların tamamı deri insizyonları aracılığıyla kesilir veya bağlanır. Kulak iskemisi; arteriyel nabzın yokluğu, kulağın görünümü, sıcaklık farkı ve deri altı oksijen satürasyonu ile doğrulanır.
Bu minimal invaziv cerrahi işlemin gerçekleştirilmesi zor görünebilir, ancak aslında oldukça kolaydır. Bu tekniğin temel avantajı, ciltte çok az hasara yol açmasıdır. Bu tekniği ilk kez 2007 yılında yayınladığımızdan beri birçok soru aldık.
Bu prosedürü daha sonra daha da basitleştirdik. Mikroskop kullanmadan uygulanmasını daha kolay hale getirmek için, öncelikle seçilen tavşanı tartarak işe başlayın ve ketamin ile ksilazin karışımı kullanarak tavşanı anesteziye alın. Tavşanın yaşamsal bulgularını izleyin; kulağı besleyen üç vasküler demet dorsal tarafta tanımlanabilir.
Bunlar; diğer damarlara bağlanan kollateralleri ile en büyüğü olan merkezi demet, arterin genellikle çok küçük olduğu veya bulunmadığı koddl demeti ve kranial demettir. Ventral tarafta, distal deri proksimal damarlardan kan desteği almaz.
Bunun yerine, kulağın dorsal bölgesindeki damar demetleri, distal ventral deriye kan sağlamak için kıkırdak boyunca çok sayıda penetran dala sahiptir. Bazı tavşanlarda, ventral tarafta ventral derinin üçte birinden fazlasına kan sağlamayan çok küçük bir subkutan damar da bulunur. Açık çevresel deri insizyonunda, ventral insizyondan esasen kanama meydana gelmez.
Devam etmeden önce, ayak parmağı sıkıştırma ve göz refleksi yöntemleriyle tavşanın ağrı uyaranlarına yanıt vermediğinden emin olun; yapay gözyaşı pomadı uygulayarak hayvanın gözlerini koruyun. Cerrahi işlem sırasında tavşanı bir ısıtma pedi ile sıcak tutun. Ardından Betadine ve alkol kullanarak her iki kulağı ve çevre dokuları temizleyin; sadece iki kulağı açıkta kalacak şekilde tavşanı örtün.
Kulaklardan biri iskemik hale getirilirken, diğeri kontrol olarak kullanılır. Cerrahi işlemde kullanılan aletler; 15 numara bıçaklı bir cerrahi bıçak, biri deri diğeri ise diğer yumuşak dokular için iki çift penset, üç adet mosquito klempli, bir veya iki çift eğri mikro makas, sütürleri ve sert dokuları kesmek için bir çift küçük makas, bir iğne tutucu ve bazı paslanmaz çelik punch'lardır.
Sürgeriye, arter ve venlere göre üç vasküler pedikülü tanımlayarak başlayın. 15 numara bıçak kullanarak merkezi vasküler pedikül üzerinde dikkatlice tek bir dikey cilt insizyonu yapın.
Merkezi veni çevre dokulardan izole edin ve koruyun. Bu adım, geri çekme işlemi için merkezi venin etrafını sarar.
Merkezi siniri serbest kalacak şekilde diseke edin. Sinir normalde venin koddle tarafında bulunur. Sinir makasla kesilir.
Merkezi arteri serbest kalacak şekilde diseke edin. Bu arter genellikle kranial tarafta ve venin daha derinindedir; arteri bağlayıp bölün. Kulak kıkırdağı üzerindeki merkezi venin çevresindeki dokuları temizleyin.
Coddle pedikülü üzerinden ikinci bir cilt insizyonu yapılır. Demeti korumak için damarlar diseke edilerek serbest bırakılır ve koruma amaçlı çevreyle çevrelenir.
Bu durum, bu tavşanda olduğu gibi venin geniş olduğu durumlarda özellikle faydalıdır. Burası ile ilk insizyon arasında bir tünel oluşturun. Kıkırdak üzerindeki deri altı dokuları kesin.
Kranial demet üzerine üçüncü bir cilt insizyonu yapılır. Bu demetin tamamı ligatize edilir ve ayrılır. Üçüncü demetin üzerindeki cilt kesilerek açılır.
Bu ven cilde çok yakındır, bu nedenle çok derin kesmeyin. Ardından tüm damar demeti diseke edilerek serbestleştirilir, bağlanır ve ayrılır. Bir bıçak ve makas kullanarak deri altı bir tünel oluşturun.
Üç insizyonla tüm deri altı dokular, kaslar, sinirler ve küçük vasküler dallar kesilir. Tabanı temizlemek için ek olarak keskin ve künt diseksiyonlar kullanarak yaklaşık beş ila 10 milimetre genişliğinde çıplak kıkırdak bırakın. Kanamalar gazlı bezle baskı uygulanarak kontrol altına alınabilir.
Elektrokoter gereksizdir. Kulağın içindeki deri, çok fazla kan taşımadığı için kesilmez. Bu prosedürün önemli yönü, damarları korurken deri altı tünelinin yeterli düzeyde diseksiyonunun sağlanmasıdır.
Bu işlem çok zor olmamalıdır. Hemostazdan sonra, üç cilt kesisi 4-0 veya 5-0 sütürler kullanılarak kapatılır ve cilt kesilerinin düzgünce kapandığından ve kanama görülmediğinden tekrar emin olunur. Yara ilaç testi için, her kulağın ventral tarafında 6 mm'lik paslanmaz çelik bir punch ile dört adet dairesel tam kat cilt yarası oluşturulabilir.
Yaralar arasındaki mesafe en az 20 ila 30 milimetredir. Punch içerisindeki deri ve perikondriyum uzaklaştırılır ancak kıkırdağa zarar verilmez. Her iki kulakta da yaralar oluşturulduktan sonra, yaralar geçici olarak gazlı bezle kapatılır ve tavşan, ilaç uygulaması için işlem odasına nakledilir.
Yaralar kan pıhtılarından temizlendikten sonra, test ve kontrol ilaçlarını uygulayın. Kurumayı önlemek için yaralar oklüzif pansumanla kapatılır. İki ilaç karşılaştırılırken, her bir ilaç hem proksimal hem de distal bir yaraya uygulanır.
Bu işlem, ameliyat sonrası kulak distal ve proksimal bölgelerindeki yara iyileşme hızları arasındaki farkı kontrol eder. İskemik kulak genellikle soğur, siyanotik bir görünüm alır ve insizyonun distalinde duyusal azalma görülür. Birkaç gün boyunca hafif ödem oluşabilir, ancak bu durum kendiliğinden geçer ve herhangi bir tedavi gerekmez.
Merkezi arter nabzı yoktur. Bazı kaslar hala kulak tabanına bağlı olduğu için kulak hareketi azalmıştır ancak tamamen ortadan kalkmamıştır. Tünel doğru şekilde oluşturulduysa, insizyonlar arasında belirgin bir girinti görülebilir.
Olası postoperatif ağrıları gidermek için sırt derisine bir fentanil yaması yapıştırılır. Kulakların her birinin deri sıcaklığı her gün bir termometre ile ölçülür. Kulaktaki kan dolaşımı, bir transkütan oksijen tansiyon metresi veya bir lazer doppler akış metresi kullanılarak ölçülür.
Bir hafta sonra, deri insizyonlarının süturları 2007'den itibaren alınabilir. Bu prosedür 70'ten fazla tavşan üzerinde uygulanmıştır. Buna 23 diyabetik tavşan ve dört yaşlı tavşan dahildir.
İskemik olmayan ve iskemik kulak arasındaki sıcaklık farkı 1 ile 10 santigrat derece arasında değişmiş olup, çoğu tavşan iki ile altı santigrat derece aralığında yer almıştır. Sıcaklık farkı ameliyat sonrası ilk günlerde daha yüksekken, 15. günden sonra kademeli olarak azalmış, ancak bir ayın sonunda hala korunmuştur. Her kulaktan altı adet doku örneği alınmış ve hem TP hem de toplam enerji olmak üzere yüksek enerjili fosfat içerikleri HPLC ile ölçülmüştür.
Konsantrasyonlar, normal kulaklarda iskemik kulaklara göre daha yüksekti. 15 diyabetik olmayan tavşanda, hem diyabetik olmayan hem de diyabetik hayvanlarda yara iyileşme süreleri iskemik kulak için her zaman non-iskemik kulağa göre daha uzundu. Ortalama iyileşme süresi, non-iskemik kulakta 17.8 gün iken iskemik kulakta 21.8 gündü.
10-12 aylık diyabetik hayvanlarda, ortalama iyileşme süresi non-iskemik kulakta 18,3 gün iken iskemik kulakta 29,1 gün olmuştur. Diyabetik tavşanlar da dahil olmak üzere tüm hayvanlarda, cilt insizyonları herhangi bir komplikasyon olmaksızın normal şekilde iyileşmiştir. 24 aylık diyabet süresinde, ventral yaraların enfekte olma eğilimi daha yüksektir.
Bu özellik, modeli insan diyabetik yaralarına daha yakın hale getirmektedir. Bir histoloji örneği, kasın bulunmadığı ve yerini fibröz dokuların aldığı subkütan tünelin iyileşmesini göstermektedir. Bununla birlikte, deri sağlamdır.
Bu prosedür uygulanırken, hayvanlara insancıl bir şekilde davranılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Biz bu tekniği, kanama veya enfeksiyon gibi herhangi bir komplikasyon gelişmeden, 23 diyabetik tavşan da dahil olmak üzere 70'den fazla tavşanda kullandık.
Bu prosedürün takip edilmesi oldukça güvenli bir işlemdir. Vasküler ülserler, basınç ülserleri ve diyabetik nöropati gibi ek sorulara yanıt verebilmek için ek iskemi, sinir hasarı ve bakteriyel inokülasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, özellikle diyabetik hayvanlar için uygun olan, tavşanlarda iskemik kulak yara modeli oluşturmaya yönelik minimal invaziv bir teknik sunmaktadır. Yöntem, cilt tahribatını en aza indirirken kan dolaşımını azaltmak amacıyla vasküler demetlerin dikkatli bir şekilde diseksiyonunu içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Yara İyileşmesi
Arka Plan
- Güncel iskemik yara oluşturma teknikleri oldukça invazivdir.
- Mevcut yöntemler diyabetik hayvanlar için uygun değildir.
- Minimal invaziv yaklaşımlar komplikasyonları azaltabilir.
- Vasküler anatominin anlaşılması bu prosedür için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Tavşanlarda iskemik yaralar oluşturmak için bir teknik geliştirmek.
- Diyabetik modellerde araştırmalar yapılabilmesini sağlamak.
- Daha geniş uygulama alanı için cerrahi süreci basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Vasküler demetlerin üzerine üç küçük cilt insizyonu yapılır.
- Santral ven ve arter izole edilip lige edilir.
- Doku hasarını en aza indirmek için bir subkütan tünel oluşturulur.
- Cerrahi işlem sonrası yara ilaç testi gerçekleştirilir.
Temel Sonuçlar
- Teknik, kulakta iskemi koşullarını başarıyla oluşturur.
- Prosedür sırasında minimal cilt hasarı gerçekleşir.
- Model, diyabetik tavşanlarda yara iyileşmesini incelemek için etkilidir.
- Geri bildirimler, prosedürün başlangıçta algılandığından daha kolay olduğunu göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu minimal invaziv teknik, diyabetik modeller için güvenlidir.
- İskemik yaraların kontrollü çalışmalarına olanak tanır.
- Yapılacak daha ileri basitleştirmeler, araştırmacıların erişilebilirliğini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
Bu teknik, diyabetik tavşanlar gibi fizyolojik direnci azalmış hayvanlarda iskemik yara modellerinin oluşturulmasına olanak tanıyarak diyabetik yara araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. İnsan diyabetik yaralarında iyileşmeyi bozan vaskülopati bileşenini yeniden oluşturarak, terapötik adayların mekanistik risk analizlerini destekler. Tek bir hayvan üzerinde uygulanan eşleştirilmiş iskemik ve iskemik olmayan yara tasarımı, öngörü güvenilirliğini artırır ve preklinik taramadaki değişkenliği azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İnsan diyabetik yara patofizyolojisini taklit eden iskemik koşullar altında terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Vasküler bağımlı iyileşme süreçlerinde yer alan hedeflerin doğrulanması için biyolojik olarak ilgili bir sistem sağlar.
- Öngörücü Değer: İskemik olmayan modellerde etkili olmalarına rağmen iskemik ortamlarda başarısız olan bileşikleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Çalışmalar arasında tutarlı bileşik değerlendirmesi için standardize edilmiş, tekrarlanabilir iskemik yara yatakları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Doku hasarını ve prosedürel karmaşıklığı en aza indirerek işlem kapasitesini artırır ve hayvanlar arası değişkenliği azaltır.
- Analiz Hazırlığı: Hayvan başına dört iskemik ve dört non-iskemik yara oluşturarak internal kontrollere ve verimli tarama iş akışlarına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: İnsan diyabetik yaralarında bulunan iskemik mikroçevreyi modeller ve preklinik etkinlik verilerinin uygunluğunu artırır.
- Risklere Göre Ayarlanmış Karar Verme: İskemik ve iskemik olmayan yaralar arasındaki farklı ilaç yanıtlarını ortaya çıkararak devam/durdur (go/no-go) kriterlerine temel oluşturur.
- Hastalıkla İlgili Sistem: 2 hafta ile 2 yıl arasındaki hastalık sürelerine sahip diyabetik hayvanlarda faydası kanıtlanmış olup kronik hastalık modellemesini destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle vasküler bozulmanın temel bir başarısızlık faktörü olduğu yaralar için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: İskemiye bağımlı yolakların hipotez testlerini destekler ve düşük perfüzyonlu ortamlarda hedef fonksiyonunu netleştirir.
- Tarama: Yüksek tekrarlanabilirlikle kantitatif yara iyileşme çıktıları sunarak güvenilir bileşik sıralamasına olanak tanır.
- Analitikler: Objektif karşılaştırma için iyileşme süresi, sıcaklık farkı ve yüksek enerjili fosfat seviyeleri gibi ölçülebilir son noktalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Yara iyileşmesindeki temel bir klinik engel olan vaskülopatiyi modelleyerek, keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Basitleştirilmiş ve sağlam prosedür, tutarlı iskemik model üretimi için farklı ekipler ve merkezler tarafından benimsenebilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Standart yara modellerinde bulunmayan temel bir patofizyolojik faktörü —iskemiyi— dahil ederek öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Minimal invaziv, standardize adımlar sayesinde cerrahi komplikasyonları, eğitim yükünü ve hayvanlar arası değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Etkisiz bileşiklerin erken aşamada tespit edilmesini sağlayarak, modellenmemiş iskemik direnç nedeniyle meydana gelen geç aşama başarısızlıklarını azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hem iskemik hem de non-iskemik koşullardaki performansa dayalı, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Arteriyel, venöz ve nöral demetlerin hassas ligasyonu için mikrovasküler diseksiyon ve sütür tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- #15 bistüri ucu, mikro makas, mosquito klempler ve cilt kapatma sütürleri dahil olmak üzere steril cerrahi enstrümanlara bağımlıdır.
- İskemiyi doğrulamak için sıcaklık probları, transkutan oksimetri veya lazer Doppler akışmetresi aracılığıyla standartlaştırılmış postoperatif izleme gereklidir.
- Model sistemler arası adaptasyon, kulak vaskülaritesi ve boyutuna bağlı olarak anatomik düzenlemeler gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: İskemik etki yaklaşık bir ay sonra kademeli olarak azalabilir, bu da zamanında son nokta değerlendirmesi yapılmasını gerektirir.
