Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Bu prosedürün genel amacı, nano çöktürme yöntemi kullanılarak polimerik nanopartiküller sentezlemektir. Bu işlem, öncelikle A-P-L-G-A PEG kopolimeri üretmek için bir E-D-C-N-H-S reaksiyonu gerçekleştirilerek sağlanır. Ardından, nano çöktürme yoluyla ilgili ilaç veya kargonun enkapsülasyonu yapılarak nanopartiküller üretmek için PLGA PEG kopolimeri kullanılır.

Bu aşamada; boyut, yüzey yükü ve ilaç yükleme etkinliği dahil olmak üzere temel biyofiziksel karakterizasyon, dinamik ışık saçılması, transmisyon elektron mikroskopisi veya HPLC aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Nanopartiküllerin düşük çözünürlüğe sahip antikanser terapötiklerini iletebilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri tümör tedavisine kadar uzanmaktadır ve bu durum mevcut tedavilerden daha etkili olabilir. Bu yöntem, kanser tedavisine dair içgörü sağlayabilir.

Ayrıca hücresel taşınım gibi diğer sistemlerin incelenmesinde de kullanılabilir. Nanopartiküller, hedefleyici bir ligand ile konjuge edilebilir ve tekniği gösteren bir görüntüleme ajanı kullanılarak in vivo veya in vitro olarak görselleştirilebilir. Bugün laboratuvarımızdan iki teknisyen, Rohit Sukumar ve Natalie Cummings eşlik edecekler. PLGA PEG kopolimer sentezine başlamak için, karboksilatlı PLGA'yı nazikçe karıştırarak 5 mM konsantrasyonda Asetonitril içerisinde çözün.

Ardından, PLGA'ya kıyasla beş kat stokiyometrik fazlalık sağlayacak şekilde 25 millimolar konsantrasyonlar elde etmek için yeterli miktarda NHS ve EDC ekleyin; PLGA karboksilatın PGA NHS'ye dönüştürülmesine izin vermek için çözeltiyi yaklaşık bir saat boyunca hafifçe karıştırın. Bir saat sonra, çözeltiye yaklaşık 10 kat hacim fazlasında yıkama çözeltisi olan metanol ekleyerek PGA NHS reaksiyon ürününü çöktürün; PGA NHS'yi peletlemek için çözeltiyi 2000 ×g'de santrifüjleyin, santrifüj işleminin ardından EDC ve NHS kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatanı atın. Metanol ile yıkama prosedürü en az üç kez tekrarlanır.

Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, yıkama çözeltisinin tüm kalıntılarını gidermek için P-L-G-A-N-H-S'yi 30 dakika boyunca vakum altında kurutun. Ardından, P-L-G-A-N-H-S peletini, başlangıçta PLGA'yı çözmek için kullanılan konsantrasyonun aynısında aceto NI trial içinde yeniden çözün.

Çözündükten sonra, PLGA çözeltisine hetero bifonksiyonel PEG ekleyin. Beş milimolar konsantrasyonda ekleme yapın.

Karışım çözeltisini 24 saat boyunca sabit karıştırma ile inkübe edin. PLGA PEG blok kopolimer reaksiyon ürününü, aşırı miktarda metanol ekleyerek çöktürün. Tüm fazla reaksiyona girmemiş PEG'i uzaklaştırmak için yıkama ve santrifüj işlemini üç kez daha tekrarlayın.

Sentezin son adımı olarak, PLGA PEG blok kopolimerini vakum altında kurutun; nanoparçacık çöktürme işlemi, PLGA PEG blok kopolimerinin ve kapsüle edilecek ilacın A-P-L-G-A çözücüsü içinde çözülmesiyle başlar. Çözücü seçimi, nanoparçacığın özelliklerini etkilediği için kritiktir. Ardından, yaklaşık 3 mg/mL nihai polimer konsantrasyonu elde etmek için polimer ilaç karışımını, karıştırılan 3 ila 10 hacim suya damla damla ekleyin. Damla damla.

Doğru boyutta nanoparçacıkların oluşması için organik çözeltinin sulu faza eklenmesi kritik öneme sahiptir. Nanoparçacıkların kendi kendine düzenleme (self-assembly) yoluyla oluşmasını sağlamak ve organik çözücü kalıntılarını gidermek için indirgenmiş basınç altında karıştırma işlemini iki saat boyunca sürdürün. İki saatlik karıştırma işleminin ardından.

Nanopartikülleri, bir Amcon filtresi kullanarak 2.700 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek konsantre edin. Ardından, hapsolmamış ilaç kalıntılarını uzaklaştırmak için nanopartikülleri PBS ile yıkayın ve işlemi santrifüj ile takip edin. Son olarak, nanopartikülleri bu aşamada PBS içerisinde yeniden süspande edin.

Nanopartiküllerin özelliklerini daha iyi anlamak için boyut, yüzey yükü ve ilaç yükleme verimliliği dahil olmak üzere temel biyofiziksel karakterizasyon gerçekleştirilebilir. Nanopartiküller, yazılı protokolde açıklandığı şekilde saklanabilir; PLGA PEG nanopartiküllerini karakterize etmek için boyut, dağılım ve yapıyı doğrulamak amacıyla transmisyon elektron mikroskopisi kullanılmıştır. Parçacık boyutu genellikle nanometre aralığındadır.

Düzensiz boyut dağılımlarına sahip büyük partikül boyutları, ya konjugasyon reaksiyonunda bir hata olduğunu ya da nano çöktürme yönteminin optimizasyon gerektirdiğini gösterebilir. Burada, Paklitaksel yükleme verimliliğinin ve salınımının standart HPLC ile kantifiye edildiği bir ilaç salınım kinetik çalışması gösterilmektedir. Nanopartiküllerin bilinen sabit miktarları, belirli zaman aralıklarında diyalize edilmiştir.

Diyaliz ünitesindeki içerik toplandı ve nanopartikülleri çözmek için eşit hacimde organik çözücü eklendi. Ardından bu örneklere HPLC uygulandı. Paclitaxel içeriğini miktar belirlemek için, uzmanlaşıldığında bu nano çöktürme tekniği üç saat içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir.

Bu tekniği uygularken, gelişimin ardından büyük partiküller oluşmasını önlemek için organik fazı her zaman sulu faza yavaşça eklemeyi unutmayın. Bu teknik, nanotıp alanındaki kanser araştırmacılarının, bu prosedürün ardından kanser hastalarında bir zamanlar çok toksik olduğu düşünülen düşük çözünürlüklü ilaçların kullanımını keşfetmelerine yol açmıştır. Düşük çözünürlüklü ilaçların etkili olup olmadığı, sistemik toksisitenin artık bir sorun teşkil edip etmediği veya hedefleme ligandlarının nanopartikülleri hedeflerine doğru şekilde yönlendirip yönlendirmediği gibi soruları yanıtlamak için in vivo etkinlik çalışmaları veya görüntüleme çalışmaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir.