Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerinden türetilen kardiyak boncuklanma kümelerinin 3D gerçek zamanlı ve yüksek uzamsal çözünürlükte in vitro olarak izlenmesidir. Bu, önce embriyonik kök hücrelerin Embry cisimciklerini oluşturana kadar kültürlenmesi ve genişletilmesiyle elde edilir. Daha sonra, çırpma kümeleri parçalara ayrılır ve POLİTETRAFLOROETILEN veya PTFE gözenekli filtreler üzerine kaplanır, bu da uzun süreli hava olarak muhafaza edilmelerini sağlar.

Sıvı kültürler daha sonra atan kümeler, gerçek zamanlı çoklu foton mikroskobu gerçekleştirmek için harmonik nanopartiküller ile etiketlenir. Elde edilen sonuçlar, mikroskobik ölçekte uzamsal uzama ve kardiyak kasılma sıklığının analizine izin verir. Bu nanopartiküllerin ana avantajı, herhangi bir dalga boyunu, özellikle de kızılötesini kullanabilmenizdir, böylece dokuda daha derine inebilirsiniz ve zamanla çok kararlıdırlar.

Böylece uzun süreçlerimizi uzun zaman dilimlerinde izleyebiliriz. Bu kök hücre kültürü yöntemi, kardiyomiyosit fonksiyonel kasılması alanındaki temel soruları üç boyutta yanıtlamaya yardımcı olabilir. Özellikle, kardiyak olgunlaşma ve doku mühendisliği.

Bireyler, yeni hastalık yöntemlerinde, harmonik nanopartiküller ile işaretleme işleminin sadece multifoton mikroskobu için kullanılabileceğini ve diğer tür görüntüleme sistemlerine aktarılamayacağını bilmelidir. İlk olarak 2005 yılında harmonik nanopartikülleri kullanma fikrimiz vardı. Bu nanopartiküller, floresan boyalar ve kuantum noktaları açısından avantajlar sunar.

Aslında, sinyalleri zamanla kaybolmaz ve uzun süreler boyunca gelişmekte olan örnekleri izlemek için kullanılabilirler. Numune hazırlamanın görsel olarak gösterilmesi, özellikle ilaç testi yapılırken farklı adımların verimliliği ve tekrarlanabilirliği için kritik öneme sahiptir ve farklı dokulara veya hastalıklara da uygulanabilir. Doku modelleme.

İnsan embriyonik kök hücrelerini veya ESC'lerini metin protokolüne göre kültürledikten ve genişlettikten ve bunları 10 dakika boyunca dört kez ılık kollajenaz ile inkübe ettikten sonra, koloni parçalarını iki mililitre taze farklılaşma, ortam veya DM'de toplayın ve yerçekiminin 115 katı basınçta üç dakika santrifüjleyin. Kültür, ultra düşük ataşmanlarda süspansiyon halinde koloni parçaları. Embriyo cisimcikleri veya ebs oluşturmalarına izin vermek için dört gün boyunca altı kuyulu plaka.

Daha sonra yeni oluşturulan EBS'yi, çırpma kümelerinin ortaya çıkmasına kadar 15 ila 30 gün boyunca% 0.1 Jelatin kaplı 24 oyuklu plaka üzerine yerleştirin. PBS'yi çıkarın ve acutus kullanarak, santrifüjleme ve resüsitten sonra kolonileri tek hücrelere ayırın, hücreleri tarım başına iki mililitre DM orta plakasında süspanse edin. Bir gün boyunca 37 santigrat derecede iyi oda ve inkübe edin.

Kültürde iki ila dört hafta sonra yeni oluşan EBS'yi ve plakayı% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plaka üzerinde oyuk başına üç plakayı toplayın. Atan kardiyomiyosit kümelerini tanımlayın ve uzun, keskin kesilmiş bir macun pipeti kullanarak, bunları manuel olarak inceleyin. Her bir uç için dört PTFE filtresi biriktirin ve her birini altı kuyulu bir plakadan oluşan bir kuyuya yerleştirin.

Her birine bir mililitre DM ekledikten sonra, her PTFE filtresine bir disseke çırpma kümesi ekleyin. Kümeleri etiketlemek için, PTFE filtrelerini çırpma kümeleriyle birlikte 3,5 santimetrelik bir cam alt tabağa aktarın. Mililitre başına 50 mikrogramda bir mililitre ikinci harmonik nesil nanoparçacık ekleyin ve doğrusal olmayan optik görüntüleme yapmak için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Etiketli HEB'leri veya kardiyak atım kümelerini bir görüntüleme odasına aktardıktan sonra, farklılaşmış EBS veya aktif atım kümeleri içindeki ilgili yapıları belirlemek için beyaz ışık aydınlatması altında geniş alan görüntülemeyi kullanın. Kardiyak kümenin genel morfolojisini yeniden oluşturmak için hızlı, düşük çözünürlüklü üç boyutlu bir tarama gerçekleştirin ve gerçek zamanlı olarak izlemek için birkaç görünür ikinci harmonik nesil nanoparçacık ile küme hacmi içinde bir görüntü düzlemi seçin. Kardiyak küme kasılmaları, mikroskop optik tarayıcısını en hızlı moda ayarlayarak iki boyutlu görüntülerin çoklu hertz ile elde edilmesini sağlar.

Dayak aktivitesini değerlendirmeden önce burada gösterildiği gibi metin protokolüne göre MATLAB yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin. PTFE filtrelerin doğrusal olmayan optik tepkisinin karakterizasyonu, çıplak substratın foton floresansına karşı çok zayıf olmasını ve ilgili biyolojik numunelerin ölçülmesini ve izole edilen emisyonun engellenememesini sağlamak için gerçekleştirilir. İkinci harmonik nesil nanopartiküller, epi algılama modunda substrat boyunca görüntüleme ile kolayca elde edilebilir.

Bu şekilde, kardiyak yapılar ve EBS olarak işaretlenmiş ikinci harmonik nesil nanopartiküller bıçak olarak gösterilmektedir. Kırmızı, sarı ve yeşil renkler NADH otofloresansına karşılık gelirken, yoğun mavi ikinci harmonik noktalar izole edilmiş ikinci harmonik nesil nanopartiküllerden kaynaklanır. Kuantum noktaları veya yukarı dönüşüm nanoparçacıkları ile karşılaştırıldığında iyi optik kontrasta ve nispeten seyrek etiketlemeye dikkat edin.

Bu şekil, kardiyak atım kümesi olarak etiketlenmiş ikinci bir harmonik nesil nanoparçacıkların bir kesit görünümünü göstermektedir. Bu filmde gösterildiği gibi, ikinci hücredeki kasılma modelini izlemek için 3D yapılar yüksek hızda kaydedilir. Harmonik üretim nanoparçacıkları, NP hareketini çözmek için yüksek bir edinme hızı oranını korumak için toplanır.

Genel edinim hassasiyeti, ikinci harmonik üretimden ikinci harmonik emisyon ile hücre otofloresansını kaydetmek için yeterli değildi. Film çerçeveleri üzerinde gerçekleştirilen nanopartiküller görüntü analizi, aynı kardiyak küme içinde yer değiştirmenin birkaç mikrometre mertebesinde olduğunu ve frekansın düz ikinci harmonik nesil nanopartikül hareketinin giriş ve çıkışı için sabit olduğunu gösterir. Hücre hazırlama tekniğine hakim olunduğunda, bahis kümesi hava sıvı kültürünü diseksiyon yapar ve uygun şekilde yapılırsa kuzulama 24 ila 36 saat içinde yapılabilir.

Özellikle bu teknikle, kontaminasyonları önlemek için açık hava temaslarından kaçınılmalıdır. Bu prosedürü takiben, aksiyon potansiyeli profillerini üç boyutta atma frekansı ile ilişkilendirmek gibi ek soruları yanıtlamak için çoklu elektrot dizileri kullanılarak elektrofizyolojik kayıtlar gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Doğrusal olmayan sinyalin harmonik nanopartiküller tarafından tespit edilmesine dayanan yeni tekniğimiz, in vivo Çalışmalar, görüntüleme için kullanılan dalga boylarını enfekte ederek dokularda daha derin penetrasyona izin vermesi için daha da geliştirilebilir.

Olası bir gelişme, rejeneratif tıp uygulamaları için kök hücrelerden türetilmiş yapının entegrasyonunu takip etmek olabilir.