Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Merhaba, ben Jersey. Merhaba, benim adım Shabi; her ikimiz de Imperial College London'da, Profesör Andrew Di Melo ve Dr. Josh Del ile mikroakışkan damlacık platformları üzerine çalışan doktora sonrası araştırmacılarız. Damlacık tabanlı mikroakışkan platformlar, çok yüksek ve hassas şekilde tanımlanmış hacimlerde üretilebildikleri ve üretim frekansları saniyede birkaç bin damlacığa kadar çıkabildiği için daha yüksek verimli deneyler adına gelecek vadeden adaylardır.

Ayrıca, ilgi alanı birkaç litrelik bölmeler içinde hapsedilebildiği için hem çapraz etkileşim hem de dağılım ortadan kaldırılabilir ve analitik süreçler daha yüksek doğrulukla zamanlanabilir. Grubumuzda, mikro damlacık platformlarını birçok uygulamada başarıyla hayata geçirdik. Örneğin; polimeraz zincir reaksiyonu, nanoparçacık sentezi ve tek moleküler hücre analizi.

Bu sistemler bünyesinde üretilen büyük miktardaki bilgiler verimli bir şekilde çıkarılmalı, dizginlenmeli ve kullanılmalıdır. Bu bağlamda, tercih edilen tespit yönteminin uygun olması, yüksek hassasiyet ve düşük tespit limitleri sağlaması, çeşitli moleküler türlere uygulanabilir olması, tahribatsız olması ve mikroakışkan cihazlarla kolay bir şekilde entegre edilebilmesi gerekir. Bu ihtiyaca cevap vermek amacıyla, küçük hacimli ortamlardan büyük miktarlarda fiziksel bilgi çıkarılmasını sağlayan ve geniş bir yelpazedeki fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerin analizinde uygulanabilen bir dizi deneysel araç ve protokol geliştirdik.

Bu protokolde, tek hücrelerin tespitine ve Dropbox'taki karıştırma süreçlerinin haritalanmasına uygulanan iki yöntemi sunacağız. Mikroakışkan çipler geleneksel olarak fotolitografi yöntemleri kullanılarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerinden üretilir. Mikroakışkan kanallar elde etmek için bu işlem bir temiz oda tesisinde gerçekleştirilmelidir; silikon gofret üzerine Spincoat ile SU-8 50 uygulayın, çözücüyü buharlaştırmak ve filmi yoğunlaştırmak için sıcak tablada 65 °C ve 95 °C'de yumuşak pişirme (soft bake) yapın, soğuduktan sonra SU-8 direnci uygun maske altında UV radyasyonu ile pozlayın ve ardından soğumayı takiben gofreti 65 °C ve 95 °C'de pişirin.

Karıştırarak, uygun geliştirme çözeltisini kullanarak pozlanmamış alanları geliştirin. Gofreti durulamak için taze EC solventi kullanın ve ardından temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kurutun. Gofreti heksan ve metanol yıkamaları ile işleyin.

Ayrıca kalıp ana üretme sürecini tamamlamak için, bir desikatör içerisinde yüzeye 40 dakika boyunca sabitleyici bir ajan buharlaştırın. Yapılandırılmış mikroakışkan altlıklar oluşturmak için, reçine çapraz bağlayıcıyı 10'a 1 oranında S guard 1 8 4 ile karıştırın ve bunu ana kalıbın üzerine çekin. Bunu bir desikatörde vakumlayarak gazını alın ve cihazı 65 °C'de kürleyin.

Kürlenmiş PDMS'i kesin ve kalıptan soyun. Bir biyopsi punch'ı kullanarak akışkan boruları için erişim delikleri açın. Başka bir PDMS tabakasını 65 derecede 20 dakika boyunca kürleyin.

Hazırlanan üst katmanı alt katman üzerine yerleştirin ve 65 derecede gece boyunca kürleyin. Çipleri Petri kabından soyun ve küpler halinde kesin. Çipler üretildikten sonra, ilgili çözeltilerin infüzyonu ile kullanıma hazır hale gelirler.

Şırıngaları, boru hatlarının hiçbir bölümünde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak gerekli çözeltilerle doldurun. Damlacık üretimi için iki faz kullanılır. Sulu dağılmış faz, ilgili reaktifleri içerir.

Yağ fazı sürekli faz görevi görür; bir ucu şırınga iğne uçlarıyla aynı iç çapta olan boruları iğnelere takın, şırıngaları bir şırınga pompasına monte edin ve istenen infüzyon akış hızını belirleyin. Her faz için, sulu fazın PDMS'yi ıslatarak dengesiz damlacık oluşumuna yol açmasını önlemek amacıyla, yağ/sulu faz akış hızları için minimum bir oran önerilir. Boruların diğer uçlarını doğrudan PDMS substratında açılmış deliklere bağlayın.

Daha karmaşık çözümler için silika, kapiler portlar veya konnektörler de uygulanabilir. Çipin çıkış portunu tübe bağlayın ve atık toplama veya daha ileri analiz işlemleri için bir toplama kabına yönlendirin. Kurulum tamamlandığında, damlacık üretmek için iki ana mikrokanal konfigürasyonu mevcuttur: akış odaklama veya T-eklemi formatı; bu geometrilerin iki kabul edilebilir akışkanı bir araya getirmek için kullanılmasıyla ortaya çıkan makaslama kuvvetleri ve arayüzde gelişen ardışık kapiler instabilite sonucunda damlacıklar oluşur.

Birkaç femtolitralık küçük, tekil dağılmış damlacıklar kendiliğinden oluşur. Damlacıklar oluşmaya başladıktan sonra, bir optik düzenek kullanılarak incelenebilirler. Optik sistem aşağıdaki protokole göre kurulur.

Otomatik altmikron konumlandırma kapasitesine sahip bir konfokal mikroskop ve ilgili floroforların absorbansı ile eşleşen bir dalga boyunda çalışan bir lazer kullanın. Floresan ömür görüntüleme için bunları uyarmak amacıyla, birkaç megahertz tekrarlama hızlarında çalışan bir darbeli lazer kullanın. Balgam deneylerinde, ışın yüksekliğinin yanı sıra ışın yönünü kontrol etmek için ışın yönlendirme aynaları ve optikler kullanılır.

Lazer ışınını objektif merceğe yansıtmak için bir dikroik ayna kullanın. Eğer iki lazer aynı anda kullanılıyorsa, çift bantlı bir dikroik ayna kurulabilir. İki lazer ışınının yansımasını sağlamak için, lazer ışığını bir mikroakışkan kanal içinde dar bir odak noktasına getirmek amacıyla sonsuz düzeltmeli yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir mikroskop objektifi kullanın.

Aynı yüksek NA objektif kullanılarak mikroakışkan kanal içindeki örnekten yayılan floresansı toplayın ve aynı dikroik aynadan geçirin. Tek veya çift bantlı bir emisyon filtresi kullanarak kalıntı eksitasyon ışığını giderin. Floresan emisyonunu 75 mikrometrelik bir pinhole üzerine odaklayın.

Plano konveks bir lens kullanarak, iğne deliğini mikroskop objektifinin konfokal düzlemine yerleştirin. Floresan sinyalini iki dedektöre ayırmak için başka bir dikroik ayna kullanın.

Dikroik ayna tarafından yansıtılan floresan ışımayı bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve düz konveks bir lens kullanarak ilk dedektör üzerine odaklayın. İkincil bir kırmızı florofor içeren deneyler için, dikroik ayna tarafından geçirilen floresan ışımayı başka bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve ardından başka bir düz konveks lens ile ikinci dedektör üzerine odaklayın. Floresan fotonlarının tespiti için avalanche fotodiyotlar kullanın.

Floresans veri toplama işlemi için, avalanche photo diode dedektöründen gelen elektronik sinyali, kişisel bir bilgisayar üzerinde çalışan veri kaydı için çok fonksiyonlu bir DAQ cihazına bağlayın. Balgam deneyleri için, bir darbeli lazer kullanın ve dedektörleri, ayrı bir bilgisayar üzerinde çalışan bir zamanla ilişkili tek foton sayım (TCS) PC kartına bağlayın. Bu kart, floresans ömür verilerinin elde edilmesini sağlar.

TCS PC metodolojisi kullanılarak; saptanan her floresan foton, gelen bir lazer darbesiyle ilişkilendirilir ve böylece yayılan her floresan fotona bir gecikme süresi atanır. Bu veriler, floroforların radyatif hızına dair bir kestirim elde etmek amacıyla tekli veya çoklu eksponansiyel sönümlenme eğrisine uydurulabilir.

Hücrelerin biyolojik, fiziksel ve kimyasal perspektiflerden oldukça heterojen olduğunu artık biliyoruz. Bu nedenle, ideal olarak her hücreyi tek tek analiz etmeliyiz. Ancak, güvenilir ve anlamlı bir sonuca varmak için yeterli nicel bilgiyi toplayabilmemiz amacıyla analizlerin yüksek verimlilikle gerçekleştirilmesi gerekmektedir.

Burada, işlemin nasıl gerçekleştirileceğini göstermek amacıyla, E. coli hücrelerinin tek bir damlacığa enkapsülasyonuna dair bir örnek sunulmuştur. Gece boyunca kültüre edilmiş E. coli TOP10 suşu kullanın. Hücrelerin canlılığını tespit etmek için cyto nine ve propidyum iyodür kullanın.

Her iki boya da DNA etkileşimli boyalardır ve floresan yoğunlukları 20 kattan fazla artar. DNA'ya bağlandığında cyto nine, membran geçirgenliği olan yeşil floresan bir boyadır; propidium iodide ise membran geçirgenliği olmayan kırmızı floresan bir boyadır.

Böylece canlı hücreler yeşil floresan yayarken, ölü hücreler hem yeşil hem de kırmızı emisyonlar sergiler. Burada, T bağlantısı ile damlacık oluşumunu ve tek bir hücrenin enkapsülasyonunu görebiliriz. Bu video yüksek hızlı bir kamera ile kaydedilmiştir, ancak damlacıklar saniyede binlerce adet olacak şekilde üretilebilir.

Hücreler enkapsüle edilirken, üretilen damlacıklardan daha az hücre bulunması için hücre kültürünün seyreltildiğinden ve hücrelerin şırıngada veya tüplerde meydana gelebilen çökelmenin önlendiğinden emin olunmalıdır. Hücrelerin çözelti içinde eşit şekilde dağılmasını sağlamak için şırınganın içinde manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Şırıngayı mikroçipe bağlamak için 50 micrometers kalınlığında çok ince tüpler kullanın.

Bu, tüp içerisinde hızlı bir akış hızı sağlayarak hücrelerin çökelmesini önler. Burada, hücre tabanlı deneyler için zamana bağlı foton sayımlarının tipik örnekleri yer almaktadır. Damlacıklar içindeki karıştırma süreçlerini haritalamak için.

Farklı ömürlere sahip iki farklı florofor kullanılarak damlacıklar oluşturulabilir. Akan bir damlacık içerisinde, başlangıçta ayrı olan iki çözeltiyi karıştırarak karıştırma işlemini geliştiren bir akış alanı oluşturulur. Kıvrımlı kanallar kullanılarak akış alanının simetrisi değiştirilebilir.

Damlacıkları incelemek için, optik prob hacmini damlacıkların aktığı bir mikrokanalın yüksekliğinin yarısına odaklayın; kanalın bir tarafından başlayarak her deneyi kanal boyunca tüm genişlikte, bir mikrometrelik aralıklarla gerçekleştirin. Damlacıklarla ilişkili tekil patlamaları (burst), yağ fazının gürültü arka planından ayırt etmek ve her patlamanın süresini belirlemek için bir algoritma uygulayın.

Deneyin gerçekleştirildiği belirli genişlikte, her bir damlacığın uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluk değerlerini çıkarmak için ikinci bir algoritma uygulayın. Ardından, deneydeki her bir damlacığın floresan ömrünü değerlendirmek için bir maksimum olabilirlik kestirimi (MLE) algoritması kullanın. Deneydeki tüm damlacıklar için ömür değerlerinin ortalamasını almak, MLE hesaplamasının nihai hatasını azaltır.

Sonda ile daha fazla damlacık incelendikçe, bir ömür yörüngesi elde edildikten sonra hata miktarı azalır. Her genişlik için tüm yörüngeleri 2B bir haritada birleştirin. Her ömür değeri iki floranın belirli bir karışımıyla ilişkili olduğundan, bu sayede bir konsantrasyon veya karışım haritası elde edilebilir.

Mikro damlacık oluşumu, bölge enkapsülasyonu ve bu işlemin optik tespiti için bir mikro cihazın üretimi, deneysel düzeneği ve ilgili protokolleri tanımladık. Seçilen iki örnek, damlacıklardaki tek hücrelerin tespitini ve damlacık içindeki karıştırma süreçlerinin haritalanmasını temsil etmektedir; bunlar, günümüzde damlacık mikroakışkanları ile araştırılan yaygın uygulama alanlarıdır.

Sunulan deneylerin gösterdiği üzere, damlacık mikroakışkan platformlarının kullanımı; mükemmel sınırlama ve daha yüksek tekrarlanabilirlik gibi yüksek verimlilik sağlayan bazı çekici özelliklere sahiptir. Üretilen bilgi miktarının fazlalığı ve bu bilginin üretilme hızının çok yüksek olması, bu minyatürize platformlardan tam anlamıyla yararlanabilmek için en yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hızlı tespit yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir.

Bu çalışmada, yüksek hassasiyetli florlu spektroskopik teknikler kullanarak bunun mümkün olduğunu gösteriyoruz.