Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Bu prosedürün genel amacı, belirli hücre tiplerinde özel olarak floresan bir marker eksprese eden bir fare hattı kullanarak, sağlam retinadaki tekil nöronların ışık yanıtlarını ve morfolojisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle izole bir retina elde etmek için gözün diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinayı bir lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirmek ve iki fotonlu kızılötesi eksitasyon yoluyla bir hücreyi görselleştirmektir.

Kayıt ve boya doldurma işlemi için ardından bir mikro pipet kullanılarak bütün hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonu sağlanır. Nihayetinde, bu hazırlık fotostimülasyona verilen hücresel yanıtların kaydedilmesine olanak tanır ve konfokal mikroskopi ile kaydedilen hücrenin morfolojisinin ortaya çıkarılmasını sağlar. Bu tekniğin, retinadan kılavuzsuz yama kenetleme kaydı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, retinayı eksitasyon ışığıyla stimüle etmeden, kaydın görsel olarak floresan işaretli bir hücreye yönlendirilebilmesidir.

Bu yöntem, belirli bir hücre popülasyonunun görsel bilgi işlemedeki katkısının ne olduğu gibi, retinal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu durum, hücre popülasyonu düşük yoğunlukta olsa ve tanımlamayı kolaylaştırabilecek belirgin morfolojik özellikler taşımasa dahi geçerlidir. Deneye, fareyi deneyden önce en az üç saat boyunca karanlığa adapte ederek başlayın.

Bu sırada, beraberindeki makalede açıklandığı şekilde hücre dışı solüsyonu hazırlayın ve oda sıcaklığında karbogen ile havalandırın. Ardından, fareyi sakrifiye edin ve kavisli iris makası ile gözleri nukle edin. Bunları hücre dışı solüsyon içeren bir kaba aktarın.

Ardından, yaylı makas kullanarak örneği bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Göz küresini ora serrata boyunca açarak korneayı ve siliyer gövdeyi çıkarın. Lensi alın ve retinayı pigment epitelyumundan dikkatlice ayırın.

Ardından, retina ile pigment epitelyumu arasındaki optik siniri kesin. Retinayı göz çukurundan çıkarın. Kıvrılmış retinanın iç kısmının ganglion hücresi tarafı olduğunu unutmayın.

Dış kısım fotoreseptör tarafıdır. Ardından, vitreusu iç retinal yüzeyden bir tahta kürdan yardımıyla nazikçe çekerek uzaklaştırın. Daha sonra, dokunun düzleştirilmesini kolaylaştırmak için retinal çevre boyunca kısa insizyonlar uygulayın.

Ardından, retinayı fotoreseptör tarafı aşağı gelecek şekilde kayıt haznesine aktarın. İnce bir fırça yardımıyla cam taban üzerine yayın ve paslanmaz çelikten yapılmış, naylon ipli bir çerçeve ile sabitleyin. Kayıt haznesini, dik konumlandırılmış bir lazer tarama mikroskobu altında karanlığa yerleştirin.

Retinal preparatı, dakikada beş mililitreden az olmayacak şekilde sürekli olarak süper perfüze edin. 35 °C'ye ısıtılmış, karbon oksijenli hücre dışı solüsyonu ile birlikte mikroskop, bir faraday kafesi içindeki şok emici hava tablası üzerine yerleştirilir. Elektronik kalkanlama için, preparatı karanlıkta tutmak amacıyla kafesi şeffaf olmayan bir perde ile kapatın.

Bilgisayar monitörlerinden gelen ışığı ayrıca kırmızı şeffaf filmlerle engelliyoruz. Kızılötesi lazeri 850 ila 870 nanometre veya daha uzun dalga boylarına ayarlayın. Mod kilitli duruma geçin ve GFP eksprese eden hücreleri görüntülemek için iki foton uyarımı kullanın.

Patch clamp kaydı için, borosilikat cam mikro pipetleri, beraberindeki makalede açıklandığı üzere floresan prob içeren hücre içi solüsyonla doldurun. Ardından mikro pipeti tutucuya yerleştirin. Referans elektrodun, kayıt odasındaki hücre dışı solüsyonla temas ettiğinden emin olun.

Ardından, 40 kat büyütmeli su daldırmalı objektif kullanarak mikro pipetle A GFP eksprese eden hücreye basınç uygulayın; Omicron hücre gövdeleri, ganglion hücre tabakasının yanı sıra interpleksiform tabakanın proksimal kısmında yer alır. Mikro pipet hedef hücreyle temas etmeden önce, retinal yüzeydeki iç sınırlayıcı membranı penetre edin. Başarılı penetrasyon, mikro pipet ucundan dışarı çıkan hücre içi solüsyon ve iç sınırlayıcı membranın altındaki retinal dokudan ayrılmasıyla anlaşılır. Hücre içi solüsiyondaki floresan boya, istenen hücreye yaklaşırken iki foton görüntüsünde mikro pipetin konumunu ortaya çıkarabilir.

Ardından mikropipetteki basıncı serbest bırakın ve tüm hücre patch clamp konfigürasyonunu elde edin. Akım klembi modunda, kullanılabilir bir kayıt eksi 50 ila eksi 55 milivolt arasında bir membran potansiyeli vermeli ve en az 20 dakika sürmelidir. Bundan sonra, bir bilgisayar monitöründe oluşturulan görsel uyarıcıları sunun.

Işın yoluna nötr yoğunluk filtreleri yerleştirerek uyarı şiddetini ayarlayın ve uyarımın mekansal konumunu kaydedilen hücrenin merkezine göre düzenleyin. Ardından, uyarım protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kayıt yazılımını tetiklemek için uyarı oluşturucuyu kullanın.

Uyaran zamanlamasının kaydını tutmak için ışın yolu üzerine bir fotodiyot yerleştirin. Mikro pipeti geri çekerken hücre gövdesini yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Boya dolumu tamamlandığında, floresan ajanın kaydedilen hücreye 30 ila 45 dakika boyunca difüze olmasını bekleyin.

Burada, promoterları altında GFP eksprese eden hücrelerin bir retinal düz montaj örneği yer almaktadır. Tirozin hidroksilaz için, GFP sinyalinin parlaklığına göre iki popülasyon ayırt edilebilir. Şekil A'daki ok başları ile gösterildiği üzere, interpleksiform tabakada yer alan tip bir dopaminerjik hücreler zayıf floresans eksprese eder. Tip iki hücreler yoğun şekilde işaretlenmiştir ve hücre gövdeleri ya Şekil A'daki oklarla gösterildiği gibi ilgili tabakada ya da Şekil B'de gösterildiği gibi ganglion hücre tabakasında yer değiştirmiş haldedir; Şekil C, tip iki hücrelerin iç pleksiform tabakanın üçüncü stratumundaki dendritik stratifikasyonunu göstermektedir; burada, izleyici neurobiotin enjekte edilmiş bir tip iki hücrenin morfolojisine bir örnek sunulmuştur.

İzleyici, burada macenta renginde gösterilen floresan işaretli streptavidine bağlanarak daha sonra görselleştirilmiştir. Burada, ganglion hücre tabakasında yer alan tip iki bir hücrenin beyaz ışığa karşı farklı yanıt modelleri yer almaktadır. Bu prosedürün ardından; uyarım anındaki, başlangıcındaki ve bitişindeki yanıt bileşenlerinin daha iyi ayırt edilebilmesi için üç saniyelik uzun süreli bir uyarım kullanılmıştır.

Retinadaki belirli bir hücre tipinin devre üzerindeki fonksiyonel rolü gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik deneyler, kalsiyum görüntüleme veya immünokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.