Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, fare vomeronazal organından alınan akut doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tek hücreli elektro-fizyolojik analizini yapmaktır. Bu yöntem, kemosensasyon alanındaki kimyasal algılama mekanizmaları gibi temel soruların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akut doku dilimlerindeki duyusal nöronlardan kayıt yaparak, bu hücrelerin kendi doğal ortamlarında araştırılabilmesidir.

Bu işleme başlamak için, hayvanı kurban ettikten sonra, ağız boşluğundan bir çift büyük cerrahi makas sokarak alt çenesini çıkarın ve her iki tarafın mandibula kemiklerini ve kaslarını ayrı ayrı kesin. Ardından, kesici dişlere daha iyi erişim sağlamak için üst çenenin derisini ve burun ucunun çevresini orta forseps ile çıkarın. Ardından, VNO kapsülünün burun boşluğundan çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesici dişlerin en büyük kısmını rostral yönde 45 derecelik bir açıyla kesmek için kemik makasını kullanın.

VNO kapsülünün ucunun zarar görmesini önlemek için diş kökünü kesmeyin. Bundan sonra, sert üst damağı orta forseps ile rostral kısmından tutun ve düz bir açıyla tek parça halinde dikkatlice soyun. Deniz boşluğunu buz gibi soğuk çözelti S2 ile tekrar tekrar durulayın. Ardından, vomer kemiğinin ucu ile çene arasındaki kemik efüzyonunu kesmek için mikro yaylı makas kullanın.

Makas uçlarını, kavisli kısım VNO'dan uzağa bakacak şekilde yerleştirin. Ve kemiği hem sol hem de sağ tarafta, VNO kapsülünün yanlarında küçük adımlarla dikkatlice kesin. VNO kapsülünü çıkarmak için, kaudal kısımdaki vomer kemiğini kesin ve orta forseps kullanarak vomer kemiğini burun boşluğundan dikkatlice kaldırın.

VNO'yu hemen bir buz jeli paketi üzerinde stereo mikroskop altında küçük bir petri kabına aktarın, burada diseksiyonun kalan adımlarının gerçekleştirilmesi gerekir. Daha sonra, dokunun kurumasını önlemek için VNO'yu az miktarda buz gibi soğuk S2 ile durulayın. Daha sonra VNO yumuşak dokularını içeren kıkırdaklı kapsülleri orta forseps ile vomer kemiğinin arkasından tutarak ayırın.

Bunun için, kapsülü dorsal bir görünüm için konumlandırın, böylece her iki VNO arasındaki bir bölünme görünür hale gelir. Her iki kıkırdak VNO kapsülünü merkezi kemikten ayırmak için ince forsepsin ucunu kullanın, aynı zamanda vomer kemiğini arka kısımda tutturun. Daha önce vomer kemiğine bağlı olan medial kıkırdak duvarının çıkarıldığından emin olun.

VNO etrafındaki kıkırdağı çıkarırken, sadece kıkırdak kapsülünün kenarında forseps kullanın. Ve hassas duyusal epitele zarar vermemek için çok dikkatli olun. Kalan kıkırdağı çıkarmak için, VNO'yu kavisli yan tarafı ile tabağın dibine çevirin ve forseps kullanarak bir taraftaki kıkırdağı güvenli bir şekilde sabitleyin.

Daha sonra doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için ikinci ince forsepsleri arka taraftan kıkırdak ve VNO arasında çok düz bir açıyla dikkatlice hareket ettirin. Duyusal epitele zarar vermemek için, VNO'yu kaudal ucunda tutarak kıkırdaktan yavaşça soyun. VNO kapsülden çıkarıldıktan sonra, kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını çıkarın, çünkü kalan kıkırdak parçaları dilimleme işlemi sırasında dokuyu çevredeki agarozdan ayıracaktır.

Daha sonra, doku hasarını önlemek için ilk diseke edilen VNO'ya küçük bir damla buz gibi soğuk S2 yerleştirin. VNO'ları gömmek için, her iki küçük petri kabını da eritilmiş S3 ile kenara kadar doldurun. Bundan sonra, her bir VNO'yu agarozun içine daldırın ve hücre dışı çözelti filmini ve yüzeyindeki hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç kez yatay olarak ileri geri hareket ettirin. VNO'yu, rostral ucu tabağın dibine bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın.

Daha sonra, her iki tabağı da bir jel buz torbasına yerleştirin ve agaroz katılaşana kadar bekleyin. Agaroz katılaşmaya başladıktan sonra VNO oryantasyonunu değiştirmeyin, çünkü bu dokuyu çevredeki agarozdan ayıracaktır. Bu prosedürde, agaroz bloğunu küçük tabaktan büyük bir petri kabının kapağına çıkarmak için küçük bir spatula kullanın ve agarozu VNO'nun rostral ucunu yukarı bakacak şekilde ters çevirin.

Ardından, cerrahi bir neşter kullanarak bloğu piramidal bir şekle kesin ve gömülü dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Ardından, piramit şeklindeki bloğu vibratom numune plakasının merkezine sabitlemek için süper yapıştırıcı kullanın. Ve tutkalın tamamen kuruması için yaklaşık bir dakika bekleyin.

Numuneyi 150 ila 200 mikrometre kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisini kısaca inceleyin. Daha sonra tüm dilimleri kullanılana kadar oksijenleme odasına aktarın.

Bu adımda, bir VNO dilimini görüntüleme odasına aktarın ve bir milometre kalınlığında sentetik liflerle bağlanmış paslanmaz çelik ankraj kullanarak dilim konumunu sabitleyin. Doku dilimini sentetik elyaf ipliklerden herhangi biriyle örtmeyin. Ardından, görüntüleme odasını kayıt kurulumuna aktarın ve dilimi oda sıcaklığında oksijenli S2 ile sürekli olarak süperfüzyon yapın.

Sürekli bir banyo çözeltisi değişimi oluşturmak için emme kılcal damarını çözeltinin yüzeyine ayarlayın. Ardından, sekizi bir arada çok namlulu bolluk kalemini, kan damarını içeren VNO diliminin duyusal olmayan kısmının üstüne ve yakınına ayarlayın. Daha sonra, 150 milimolar potasyum klorür ile doldurulmuş L şeklindeki agar köprüsünü kullanarak referans elektrodu ve banyo solüsyonunu bağlayın.

Ardından, yama pipetini pipet çözeltisi S4 ile doldurun. Pipeti, kaplamayı kazımadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı elektrotun üzerine monte edin ve sıkıca takın. Ardından banyoya girmeden önce yama pipetine hafif pozitif basınç uygulayın. Pipeti izleyin ve dört megaohm ile 10 megaohm arasında olduğundan emin olun.

Kızılötesi optimize edilmiş DIC kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilimini görselleştirin ve floresan aydınlatması ve uygun bir filtre küpü kullanarak FPR-rs3 i-Venüs eksprese eden hücreleri veya benzer şekilde etiketlenmiş nöronları tanımlayın. Maksimum hassasiyet için el çarklarını kullanarak hücre gövdesine yaklaşın. Pozitif basınç nedeniyle, pipet ucu yakın olduğunda hücre soma zarı üzerindeki küçük bir çukur görünür hale gelir.

Daha sonra pozitif basıncı serbest bırakın ve bir ila 20 gigaohm arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için hücre zarını emmek için hafif bir negatif basınç uygulayın. Daha sonra, hücre zarını bozmak ve tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için kısa ve yumuşak emme uygulayın. Bu şekilde, bir koronal VNO doku diliminin konfokal görüntüsü, vomeronazal duyusal epitelde floresan FPR-rs3 Tau Venüs pozitif nöronlarının dağılımını göstermektedir.

FPR-rs3 Tau Venüs pozitif nöronları, luminal sınırda topuz benzeri bir yapı ile biten tek bir apikal dendrit sergiler. Ve burada VSN soma'dan gerçekleştirilen tüm hücre yaması kelepçe kayıtları gösterilmektedir. İşte TTX'e duyarlı hızlı aktive olan sodyum akımının ve FPR-rs3 pozitif VSN'lerin toptan yama kelepçesi kayıtlarından temsili izler.

Kontrol koşulları altında voltaj kademesi kayıtları, voltaja bağlı hızlı ve geçici bir içe doğru akımı ortaya çıkarır. Bir mikromolardaki TTX tedavisi akımı güçlü bir şekilde azaltır. Ve burada gösterilen dijital olarak çıkarılan iz, TTX hassas voltaj kapılı sodyum akımını ortaya çıkarır.

Temsili akım kelepçe izleri, depolarizasyonu ve hiper-polarizasyonu ve kademeli pozitif ve negatif akım enjeksiyonu üzerine üretilen aksiyon potansiyelleri dizilerini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm diseksiyon ve doku dilimleme işlemi her iki VNO için yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, daha büyük nöron popülasyonlarını analiz ederken verimi artırmak için hücre dışı gevşek yama kayıtları veya kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ağız vomeronazal organından akut doku dilimlerinin nasıl yapıldığını ve vomeronazal duyu nöronlarından tek hücreli elektro-fizyolojik kayıtların nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.