Vasküler Ca Görselleştirme ^{2 +} Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Bu prosedürün genel amacı, perikrin kaynaklı reaktif oksijen türleri veya ROS tarafından tetiklenen vasküler kalsiyum sinyalizasyonunu görselleştirmektir. Bu, öncelikle aktif makrofajlarda oksidasyona duyarlı boyalar kullanılarak ROS'un görselleştirilmesiyle gerçekleştirilir. ROS, aynı zamanda plazmid tabanlı floresan sensörler kullanılarak endotel hücrelerinde de görselleştirilebilir.

Ardından, bir ko-kültür modelinde cell tracker red ile işaretlenmiş aktive makrofajların ve flu of four ile işaretlenmiş endotel hücrelerinin eş zamanlı olarak görüntülenmesine geçin. Son olarak, bir konfokal görüntüleme sistemi kullanarak, makrofaj kaynaklı ROS tarafından tetiklenen endotel hücrelerdeki kalsiyum sinyalini ölçün.

Bu sonuçlar, ROS seviyelerini bağımsız olarak gösterebildiği gibi, Peregrine kaynaklı ROS tarafından tetiklenen hücre içi kalsiyum mobilizasyonunu da eş zamanlı olarak değerlendirebilir. Bu yöntem, vasküler sinyallemeyi ve simülatör patofizyolojik ortamı yakından tetikleyen iki farklı sinyal molekülünün eş zamanlı değerlendirilmesine olanak tanır. Laboratuvarımdaki iki doktora sonrası araştırmacı, Karthik ve Raj, prosedürü ham ve kalsiyum ölçümleri ile makrofaj endotel hücre etkileşimleri üzerinde göstereceklerdir.

Fare monosit türevli makrofajları cam tabanlı 35 milimetrelik kaplarda kültüre edin. Ardından hücreleri toll-benzeri reseptör agonistleri ile uyarın ve 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Sitolzolik kısmın görselleştirilmesi için.

ROS için oksidasyona duyarlı boya ekleyin ve hücreleri 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri konfokal görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü tablasında görüntüleyin. Alternatif olarak, TLR aktive edilmiş hücrelerdeki mitokondriyal ROS'u görüntülemek için mitokondriyal süperoksit indikatörü ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Negatif kontrol için hücreleri PBS ile, pozitif kontrol için ise DMSO ile işleme tabi tutun. Pozitif kontrol grubu olarak hücreleri 2 mM antimycin ile işleyin. Ardından, konfokal bir görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü tablasında tüm hücreleri görselleştirin.

Image J yazılımını kullanarak tüm görüntü verilerini analiz edin. Floresan sensör, sub mikromolar peroksit konsantrasyonlarını yüksek spesifiteyle algılar ve memeli ekspresyonuna dayanarak vektör tasarımı sitoplazmaya veya mitokondriye yönlendirilebilir. Elektroporasyon kullanarak, uygun olmayan hiper ekspresyon plazmidi taşıyan fare pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin stabil hatlarını oluşturun.

Koloni büyümesini kolaylaştırmak için hücreleri düşük yoğunlukta tamamlanmış TMEM içerisinde plaklara ekin ve 48 saat boyunca inkübe edin, ardından besiyerini selektif bir antibiyotik ile desteklenmiş tamamlanmış kültür besiyeri ile değiştirin. En yüksek hiper pozitif hücre yüzdesine sahip klonları tarayın ve bireysel deneylerde stabil hiper pozitif hatlar oluşturmak için kültürü amplifiye edin. Hücreleri %0,2 jelatin kaplı lameller üzerine ekin ve %80 konfluense ulaşana kadar gece boyunca kültüre edin.

Şimdi hücreleri TLR ligandları ile aktive edin ve 37 °C'de altı saat inkübe edin. Sitoplazmik ROS tespiti için, hücrelerin bulunduğu lamelleri bir adelo hücre odasına yerleştirin. Bir mililitre önceden ısıtılmış Hank's dengeli tuz çözeltisi ekleyin ve odayı konfokal görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü tablasına yerleştirin.

Mitokondriyal ROS tespitine yönelik hücrelerdeki floresan değişimlerini kaydedin. Pozitif kontrol olarak iki mikromolar antimycin A ekleyin. Ardından, işlem görmüş hücrelerin bulunduğu lamelleri konfokal mikroskopi için hazırlayın. Görüntü analizi işlemlerini image J yazılımı kullanarak gerçekleştirin.

Hücre içi kalsiyum değişimlerini görüntülemek ve ölçmek için, jelatin kaplı cam lameller üzerinde %80 konfluense ulaşmış endotel hücrelerle başlayın. Boya kaybını en aza indirmek için hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca floresan boya flu oh 4:00 AM ile inkübe edin; ardından hücreleri suen pyro zone içeren deneysel görüntüleme çözeltisi ile yıkayın. Şimdi, lamelleri 800 µL önceden ısıtılmış deneysel görüntüleme çözeltisi ile bir adelo hücre odasına yerleştirin ve hücreleri, ayrı bir tüp içindeki konfokal görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü tablasına konumlandırın.

İncelenen makrofaj popülasyonunu işaretlemek için 500 nanograms per milliliter cell tracker red C-M-T-P-X'i 15 dakika boyunca kullanın; hücreleri yıkayın ve pelletleri 200 microliters deneysel görüntüleme çözeltisinde yeniden süspande edin. Şimdi, işaretli makrofajları konfokal oda kurulumundaki flu oh 4:00 AM yüklü endotel hücrelerinin üzerine ekleyin. Yeşil ve kırmızı floresan스를 10 dakika boyunca her üç saniyede bir kaydedin.

Bu deneyde, J 7 74 0.1 hücreleri altı saat boyunca TLR iki, üç ve dört ligandları ile uyarılmıştır. Temsili konfokal görüntüler, DCF ile ölçüldüğü üzere artmış sitozolik ROS göstermektedir. İlginç bir şekilde, mitoses socks kırmızı floresansı, mitokondriyal ROS'ta da benzer bir artışa işaret etmektedir.

Bu floresans değişimleri kantitatiftir. Bu nedenle sonuçlar normalize edilmeli ve tedavi başına göre bağıl kat değişimi olarak ifade edilmelidir; antimisin A sinyali, mitokondriyal ROS üretimi için pozitif bir kontrolü doğrular. Bu şekil, stabil olarak ifade edilen hyper cyto veya hyper D mito hücrelerindeki endotelyal, sitozolik ve mitokondriyal peroksit seviyelerinin görüntülerini göstermektedir.

TLR agonistleri ile stimüle edilmiş MP ECS. Ortalama floresan değişiminin kantifikasyonu, bir ko-kültür sisteminde altı saatlik stimülasyon sonrası hiper cyto ve hiper D mito floresanında artış olduğunu göstermektedir. Peregrine ROS sinyalini değerlendirmek için, hem yabani tip hem de GP 91 Fox null farelerden taze izole edilen mirin makrofajları, bir mikrogram per mililitre LPS ile altı saat boyunca aktive edilmiştir.

Makrofajlar C-M-T-P-X ile kırmızıya etiketlendi ve yeşil floresan yüklü MPM ECS üzerine eklendi. İlginç bir şekilde, yabani tip farelerden izole edilen LPS aktive makrofajlar, GP 91 Fox null farelerden alınan makrofajlara kıyasla MPM ECS'de geniş ve hızlı bir kalsiyum mobilizasyonunu tetikledi.

Bu prosedür uygulanırken, uzun süreli indirme veya lazer maruziyetinin DCF'nin oto-oksidasyonuna yol açabileceğini unutmamak önemlidir. Hyper cyto ve hyper D mitral'in fotobeyazlamasından (photo bleaching) kaçınmak kritik öneme sahiptir. Yöntemye hakim olunduğunda, uygun şekilde gerçekleştirildiği takdirde makrofajların yanı sıra endotel hücrelerinde RA ölçümü yedi saat içinde tamamlanabilir.