Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Bu prosedürün genel amacı, mekanik yükün tekil proteinlerin proteolitik parçalanması üzerindeki etkisini yüksek düzeyde paralel ve maliyet etkin bir şekilde incelemektir. Bu gösterimde, ilk adımda matris metalloproteinaz bir tarafından kolajenin parçalanması incelenmekte, ardından akış hücresinin cam lameline kolajen kırpıcılar tutturulmakta ve ardından tekil kolajen moleküllerine mikrometre boyutunda manyetik boncuklar bağlanmaktadır. İkinci adım, akış hücresinin manyetik cımbız düzeneğine yerleştirilmesi ve spesifik olmayan şekilde bağlanmış boncukların lamel yüzeyinden uzaklaştırıldığının kontrol edilmesidir.

Ardından, proteaz akış hücrelerine eklenir. Son adım, boncuk ayrılmasını gerçek zamanlı olarak izleyerek proteoliz hızını belirlemektir. Farklı proteaz konsantrasyonlarında ve kuvvetlerde boncuk ayrılma hızları ölçülerek, çok küçük miktarlarda substrat ve proteaz kullanılarak standart zoolojik kinetik parametrelerin türetilmesi mümkündür.

Ayrıca bu teknik, mekanik kuvvetin proteoliz hızı üzerindeki etkisi ve kesilme işlemine eşlik eden substrat proteinindeki yapısal değişiklikler hakkında benzersiz bilgiler sağlar. Bu tekniğin optik T izleri ve atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemlere kıyasla temel avantajı, yüksek verimli ve maliyet etkin olmasıdır. Bu yöntem, tekil proteinlerin proteolitik kesilmesi üzerindeki etkili kuvvete dair içgörü sağlayabilse de, kullanılan cihazlar ve teknikler, kuvvetin protein katlanması ve konformasyonu üzerindeki etkisi dahil olmak üzere geniş bir biyofiziksel problemler yelpazesine uygulanabilir.

Lamel temizleme işlemiyle akış hücresi hazırlığına başlayın. Lamelleri, sonikatöre sığabilecek küçük bir cam kaba yerleştirin. Kabı izopropanol ile doldurun ve banyo tipi sonikatörde 20 dakika boyunca sonikasyon uygulayın, ardından izopropanolü boşaltın ve lamelleri bol miktarda deiyonize su ile durulayın.

Kabı suyla doldurun ve 20 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyon işleminden sonra lamelleri filtrelenmiş, tozsuz bir hava akımı altında kurutun. Lamelleri inceleyin ve yalnızca lekesiz olanları kullanın.

Kalan toz ve nemden arındırmak için lamelin bir bunsen beki tarafından üretilen gaz alevinden geçirilmesiyle lamelleri birkaç saniye boyunca nazikçe alevleyin; aşırı ısı nedeniyle lamelin deforme olmamasına dikkat edin. Bu adım, yüzeydeki kalıntı kirleticileri uzaklaştırır.

Ardından, iki lamelini birbirine yapıştırmak için çift taraflı şeffaf bant kullanın. Bant yaklaşık üç santimetre uzunluğunda ve 0,3 santimetre genişliğinde olacak şekilde kesilip 22 by 40 milimetrelik bir lamelin üzerine, ortada 1,6 santimetrelik bir kanal kalacak şekilde yapıştırılır. Bandın düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için bir pipet ucuyla lamelin üzerine hafifçe bastırın.

Manyetik cımbız düzeneği, bu laboratuvar tarafından bir milimetre çapında iğne deliği bulunan alüminyum bir L braket kullanılarak oluşturulmuş ve cımbızın yüksekliğini ayarlamak için dikey bir Z translatörüne monte edilmiştir. Manyetik alan gradyanı oluşturmak için iğne deliğinin her iki yanındaki brakete iki adet kalıcı nadir toprak mıknatısı tutturulmuştur. Manyetik tuzağın uygun şekilde kalibre edilmesi bu prosedür için esastır.

Başarıyı sağlamak için bu bölümde özetlenen iki farklı yöntem kullanıyoruz. Manyetik tuzağı kalibre etmek için, yazılı protokolde açıklandığı üzere 5' ve 3' uçları biyotin ve digoksin ile işaretlenmiş, önceden hazırlanmış Lambda faji DNA'sı kullanın. DNA'yı akış hücresine tutturmak için önce akış hücresini anti-digoksin antikor çözeltisiyle doldurun ve antikorun cam yüzeye tutunması için 15 dakika bekleyin.

Ardından, DNA'nın spesifik olmayan şekilde yapışmasını önlemek için akış hücresine bir BSA çözeltisi ekleyerek akış hücresinin yüzeyini bloke edin. Bu bloklama adımı ve sonraki tüm adımlar için, akış hücresine eklenen reaktif hacminin en az iki katı olması gerektiğini unutmayın. Bu gösterimde 75 µL olan akış hücresi hacmine uygun olarak, akış hücresini oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Bu adım tekrarlandıktan sonra, 50 pico molar fonksiyonelleştirilmiş lambda DNA ekleyin ve lamel üzerine tutunması için 15 dakika bekleyin, ardından fazla DNA'yı bir kez XPBS ile yıkayarak uzaklaştırın. Son olarak, streptavidin kaplı süper paramanyetik boncuklar ekleyin ve immobilize DNA'ya tutunmaları için 15 dakika bekleyin. Bu gösterimde 2.8 mikrometre boncuklar kullanılmıştır.

Fazla boncukları bir kez XPBS ile yıkayın. Ardından, kalıcı mıknatısları örnek yüzeyinden uzak bir konuma getirerek manyetik cımbız kalibrasyonunu gerçekleştirin. Sonrasında, hazırlanan akış hücresini mikroskoba yerleştirin.

Kalıcı mıknatısları akış hücresinin üzerindeki konumlarına yerleştirin. Her iki cam yüzeyden uzaklaşarak boncuklara odaklanıp Lambda DNA ile fonksiyonelleştirilmiş boncukların odak düzlemini seçin. Doğru odak düzlemi, istenen boncukların parlak bir merkeze sahip olduğu düzlemdir.

500 kare boyunca 80 hertz'den daha yüksek bir hızda boncuk hareketinin videosunu çekin. Mıknatısı örnek yüzeyine yaklaştırın ve her konumda boncuk hareketinin videosunu kaydedin. Beş milimetrenin üzerindeki mesafeler için bir milimetrelik artışlarla ilerleyin; bir ile beş milimetre arasındaki mesafeler için ise uygun artışlarla hareket edin.

Bir milimetreden kısa mesafeler için 0,5 milimetrelik artışlarla, daha kısa mesafeler için ise 0,25 milimetrelik artışlarla ilerleyin. Her veri seti için boncukların merkezini 2B Gauss uydurması kullanarak takip edin. Yazılı prosedürde açıklandığı üzere, Brownian dalgalanmaları aracılığıyla kuvveti hesaplayın. Kuvvetlerin doğruluğunu, kuvvet hesaplamasını bir güç spektrumu çizgisel uydurması ile kontrol ederek onaylayın.

Kesme frekansını bulmak için, uygulanan kuvvet ile kesme frekansı arasındaki ilişki, kolajen peptidin akış hücrelerine bağlanmasından önceki metinde bulunabilir; kolajen peptit ve MMP1 proteinlerini eksprese edin ve saflaştırın. Anti-MIC antikor çözeltisini akış hücresine ekleyerek başlayın ve anti-MIC'in akış hücresinin yüzeyine bağlanması için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için akış hücresini 5 mg/mL BSA ile bloke edin. 150 pM kolajen peptit ekleyin ve M-tag aracılığıyla antikora 45 dakika boyunca bağlanmasını sağlayın.

Akış hücresine 2.8 mikrometre boncuklar eklemeden önce, fazla kolajeni PBS tamponu ile yıkayarak uzaklaştırın. Boncuklar, güçlü mıknatıslar kullanılarak strep divid ve kaplı boncuk solüsyonundan ayrılmalı, ardından PBS içinde yeniden süspande edilmelidir. Bu işlem üç kez tekrarlanmalıdır.

Bu adım, 2,8 mikrometre boyutundaki boncukların yüzeye immobilize edilmiş kolajen peptide bağlanmasını sağlamak için gereklidir. Ardından, strep divid streptavidin kaplı süper paramanyetik boncuklar ekleyin ve bunların kolajen moleküllerine bağlanması için 45 dakika bekleyin. Akış hücresi kolajen peptid ve manyetik boncuklarla kurulduktan sonra, manyetik tuzak içindeki akış hücresini görüntüleyin.

Düşük kuvvet altında, boncukların bir alt popülasyonu bazen zayıftır ve yüzeye spesifik olmayan bir şekilde tutunmuştur. Orta düzeyde kuvvet uygulanması, bu boncukların serbest kalmasını sağlar. Akış hücresine aktive edilmiş enzim ekleyin.

Bu vakada, MMP1, 3,5 mM PMA eklenerek önceden aktive edilmiş ve 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edilmiştir. Akış hücresi manyetik cımbız düzeneğine yeniden yerleştirilir yerleştirilmez, tipik olarak birkaç yüz bağlı boncuk içeren birkaç görüş alanını kapsayan bir video kaydedin. Bu ölçüm, zaman eşittir sıfır anına karşılık gelir.

Tüm boncuklar ayrılana veya daha fazla proteoliz gözlemlenmeyene kadar, düzenli zaman noktalarında birkaç görüş alanının kaydedilmesi işlemini tekrarlayın. Manyetik cımbızlar, bir mikrometre ve 2,8 mikrometre boncuklar için kalibre edilmiştir. Zorlanmış proteoliz deneylerinde, hem gözlemlenen brownian dalgalanmalarının büyüklüğü hem de farklı mıknatıs konumlarındaki roll-off frekansının hesaplanması kullanılarak, kalan boncukların normalize edilmiş sayısı, proteoliz hızını belirlemek amacıyla zamana bağlı bir fonksiyon olarak grafiklenebilir.

Ve bu işlem, farklı enzim konsantrasyonları ve kuvvetler için tekrarlanabilir. Proteoliz hızları, uygulanan kuvvete bağlıdır. Proteoliz hızları 1 pN, 6,2 pN ve 13 pN değerlerinde belirlenmiştir.

Boncukların çözülme oranı 15 dakikanın üzerinde olduğunda, farklı deneyler boyunca yaklaşık 0,25 değerinde sabit kalmaktadır. Bizim durumumuzda bu analiz, MMP one'ın katalitik verimliliğini uygulanan kuvvetin bir fonksiyonu olarak ölçmemize olanak sağlamıştır. Verileri analiz ederek, proteoliz öncesinde kolajen üçlü heliksin yerel olarak açılması gerektiğini tespit ettik.

Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Verilerinizin iyi bir istatistiksel anlamlılığa sahip olması için görüş alanı başına en az 30 ila 50 boncuk gerektiğini unutmamak önemlidir. PMA'nın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu deneyi gerçekleştirirken her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz maskesi gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, manyetik cımbızlar kullanarak tekil proteinlerin proteolitik kesilmesi üzerindeki kuvvet etkisinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Manyetik cımbızlar, tek moleküllü biyofiziksel deneyleri anlamak için harika bir araçtır. Bu teknik, diğer proteaz ve substrat kombinasyonlarına da genişletilebilir.

Ek olarak, protein yapısal dinamiklerini anlamanın yanı sıra RNA ve/veya DNA'ya bağlanan veya bunları modifiye eden diğer proteinleri anlamak için de benzer teknikler kullanılabilir.