Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Bu prosedürün genel amacı, 100 nanometre uzunluğundaki kısa DNA moleküllerini, sabit ve iyi kalibre edilmiş optik kuvvetlerle manipüle etmektir. Bu işlem, DNA'nın bir ucunun bir örtü camına, diğer ucunun ise bir polistiren mikroküreye bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, optik cımbızlar hizalanır ve kalibre edilir.

Ardından, mikroküreye etki eden gradyan kuvvetleri ve saçılma kuvvetlerinin kombinasyonu ile DNA yüzeyden uzaklaştırılır. Son olarak, boncuk potansiyelin lineer bölgesinde hapsedilerek DNA genişletilir. Bu protokol, DNA'nın mekanik özelliklerini ve DNA-protein bağlanma kinetiğini incelemek için kullanılmış ve ayrıca kısa DNA konstrüktlerinin elastikliği üzerinde sınır koşullarının öneminin aydınlatılmasında faydalı olmuştur.

Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sabit kuvvetli optik cımbızların hizalanması ve kalibrasyonunun zor ve karmaşık olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Optik cımbızlar, iki ortogonal polarize ışına ayrılan 1064 nanometre lazerden gelen bir ışını içerir. Bunlardan biri biyomolekülü manipüle etmek için, diğeri ise kalibrasyon amaçları için kullanılır.

Manipülasyon ışınının yoğunluğu, bir AO optik deflektör veya bir OD ile kontrol edilir. Işınlar daha sonra başka bir polarize ışın ayırıcı ile yeniden birleştirilir. Işınlar, bir plan APO 60 x 1.4 yağ daldırma mikroskop objektifi ile örnek hücresi üzerine sıkıca odaklanır. Bu cımbız düzeneği, bir kondansatör aracılığıyla örnek haznesine odaklanan halojen lambadan aydınlatma sağlayan, laboratuvar bünyesinde yapılmış bir parlak alan mikroskobu ile birleştirilmiştir.

Aydınlık alan görüntüsü, dikroik bir ayna aracılığıyla lazer ışığından ayrılır ve ardından iki CCD kameraya aktarılarak görüntülenir. CCD'lerden biri, veri toplamanın temel yöntemi olarak işlev görür ve hassas örnekleme hızları sağlamak için yazılım tarafından tetiklenir. Diğer CCD ise, konumu mikroskoptaki kaymaları telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak kullanılan, sabitlenmiş tek bir referans mikrokürenin görüntülenmesi için kullanılır.

Numune, bir XY tablası ile objektife göre kaba olarak konumlandırılır ve ardından gömülü üç boyutlu bir piezo tablası ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir. İleri saçılan ve iletilen lazer ışığı, parlak alan kondansatörü tarafından toplanır ve boncuğun boyutunu kalibre etmek için bir foto dedektöre odaklanır; fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş, 800 nanometre çapında polistiren mikrokürelerin dağılmış bir çözeltisi ile bir numune haznesi doldurun. 10 ila 15 dakika bekletin ve ardından tamponla hafifçe yıkayın.

Fazla mikroküreleri uzaklaştırmak için, lamel camına rastgele yapışmış bir mikroküre belirleyin ve mikroküre odak noktasının yaklaşık bir mikrometre altına gelene kadar örnek haznesinin yüksekliğini ayarlayın. LabVIEW kullanarak görüntünün görünür boyutunu ölçmek amacıyla defokuslanmış bir görüntü oluşturmak için öncelikle geometrik desen eşleme işlevini kullanarak mikrokürenin merkezini bulun. Ardından, 360 derece üzerinden ortalama alarak mikrokürenin radyal yoğunluk profilini oluşturun.

Her bir enine kesitin merkezi çevresinde, parlak alan görüntülerinin her birindeki beyaz halkaya karşılık gelen radyal profile kuadratik bir fonksiyon uydurulur. Parlaklık zirvesini bulmak için, bu zirve ile merkez arasındaki mesafe, boncuğun görünür boyutunun bir ölçüsü olarak kullanılabilir; kalibre edilmiş piso tablasını kullanarak mikrokürenin eksenel konumunu kademeli olarak artırın ve her eksenel konumda CCD kamera ile bir görüntü alın. Mikrokürenin görünür boyutunu eksenel konumuyla ilişkilendirmek için görüntü analizini her bir ardışık görüntü için tekrarlayın.

Bu yöntemle elde edilen eksenel çözünürlük, manipülasyon ışınının optik potansiyelini haritalamak için yaklaşık 1,4 nanometredir; manipülasyon ışını kapalıyken, manipülasyon ışını ile kalibrasyon ışınını koline ederek hizalamayla başlayın. Serbest bir mikro küreyi, kalibrasyon ışınının çok daha sert olan tuzağına hapsedin. Şimdi manipülasyon ışınını açın.

Kalibrasyon ışınından çok daha zayıf olduğu için, mikrokürenin eksensel konumu hafifçe değişecektir. Eksenel konumda meydana gelen bu değişim, daha önce açıklandığı üzere defokuslanmış parlak alan görüntülerinden ölçülebilir. Eksenel odağı kaydırın ve tekrarlayın; yer değiştirme delta X'i, kalibrasyon ışınının odağının eksensel konumuna karşı grafiğe dökün.

Mikrosferin en büyük yer değiştirmesine karşılık gelen eksenel konum, optik tuzağın doğrusal bölgesinin merkezini belirler. Bir DNA örneğini germek için, yüzeye bağlı DNA molekülleri içeren hazneyi yerleştirin ve parlak alan görüntüsünü gözlemlerken, teleskobu ayarlayarak manipülasyon demetinin odağını gerilmemiş mikrosferlerin biraz üzerine getirin, ardından mikrosferlerden biri yakalanana kadar sahnenin konumunu ayarlayın. Mikrosferi optik tuzağın XY düzleminin merkezine yaklaşık olarak konumlandırın, LabVIEW'da bir dizi kare dalga oluşturun ve lazer demetini tekrarlayan şekilde açıp kapatmak için bunları A OD'ye gönderin.

Tuzak tekrar tekrar açılıp kapatılırken mikro küreyi izleyin. Ve X ve y yönlerinde mikro küre konumunu iteratif olarak ayarlarken, lazerin mikro kürenin hareketine herhangi bir tercih edilen yön kazandırıp kazandırmadığını not edin. Piso tablası kontrol edilerek, lazer açıkken belirgin şekilde kısıtlansa da mikro kürenin rastgele hareketinin X-y düzleminde izotropik hale gelmesi sağlanmalıdır.

Ardından, boncuğu Z yönünde hizalayın. Lazer ışınını tekrar kısa aralıklarla açıp kapatın; ancak bu kez mikro kürelerin eksenel yer değiştirmesini gerçek zamanlı olarak eş zamanlı ölçün.

Sahneleri, DNA rampasını germek için Z yer değiştirmenin en fazla olduğu nokta olan doğrusal bölgeye ortalayın; A OD'ye sıfır volttan 0,5 volta kadar 0,025 voltluk adımlarla voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğunu ayarlayın. Saniyede 100 kare olacak şekilde 400 kare kaydedin ve eksenel yer değiştirmeyi elde etmek için bunları ortalayın. Son olarak, kuvvet-uzama eğrilerini çizin ve bunları modifiye edilmiş solucan benzeri zincir modeline uydurun.

Burada, kısa DNA dizileri için 1, 298 baz çifti ve 247 baz çifti uzunluğundaki 2D NA dizilerine ait kuvvet-uzama eğrileri gösterilmektedir. Geleneksel solucan benzeri zincir veya WLC modeli, kuvvet-uzama ilişkisini tam olarak açıklamamaktadır; çünkü bu uzunluk ölçeklerinde, sonlu boyut etkileri ve sınır kısıtlamalarından kaynaklanan sıfır kuvvet uzaması hesaba katılmalıdır. Bu nedenle, kuvvet-uzama ölçümlerinin, ek materyallerde daha ayrıntılı olarak açıklanan etkili bir kalıcılık uzunluğu ve sıfır kuvvet uzamasının uyum parametreleri olduğu modifiye bir WLC modeli kullanılarak uydurulması gerekmektedir.

D-S-D-N-A'nın büyük kontur uzunlukları için etkili kalıcılık uzunluğu, basitçe yaklaşık 50 nanometre olan nominal kalıcılık uzunluğudur ve sıfır kuvvet uzaması modifiye edilmiş WLC uyarlamalarında ihmal edilebilir. Etkili kalıcılık uzunlukları, geliştirilmesinin ardından 298 baz çiftli DNA için 35 nanometre ve 247 baz çiftli DNA için 25 nanometredir. Bu yöntem, düzenleyici protein aracılı DNA döngülerinin oluşum ve yıkım kinetiğinin incelenmesi dahil olmak üzere, DNA ve DNA-protein kompleksleri üzerinde bir dizi nanomekanik ölçümün önünü açmıştır.