Hücre içi Refolding Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ısı şoku sonrası şaperon bağımlı hücre içi protein yeniden katlanmasını ölçmektir. Bir lusiferaz raporlayıcısı kullanarak, öncelikle hücreleri lusiferaz raporlayıcı genini ve ilgili şaperonu içeren plazmidlerle transfekte edin. Ardından, transfekte edilmiş hücreleri deneysel tasarımdaki geri kazanım zaman noktaları için gruplara ayırın.

Ertesi gün, protein açılımını indüklemek için hücrelere ısı şoku uygulayın. Hücre içi protein katlanmasının yeniden sağlanması için toparlanma süresi tanıyın ve ardından lusiferaz raporlayıcı aktivitesini ölçün. Sonuçlar, lusiferaz analizi temelinde zamana ve şaperona bağımlı protein yeniden katlanmasını ölçer.

Bu tekniğin in vitro refolding deneyi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bileşiklerin veya proteinlerin şaperon aktivitesi üzerindeki etkisine dair fizyolojik bir okuma elde edebilme imkanıdır. Şaperonlar bu patolojilerin gelişiminde önemli bir rol oynadığı için, bu tekniğin doğurguları nörodejeneratif hastalıklar veya kanser gibi geniş bir hastalık yelpazesinin tedavisine kadar uzanmaktadır. İlk olarak, kültür ortamını, PBS'yi ve tripsini bir su banyosunda 37 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun.

Konfluen bir HEK 2 93 hücre kültürünü beş mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, %0,025 EDTA içeren bir mililitre tripsin uygulayın; tripsinin eşit dağılması için plakayı nazikçe döndürün ve 37 °C'de inkübe edin. Hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için plakayı periyodik olarak sallayın.

Şimdi hücreleri 10 mililitre komple DMEM besiyerinde tekrar süspanse edin ve 50 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Ardından, bir Beckman sayıcı plaka kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri yaklaşık %60 ila %70 konfluensle ekimleyin ve altı ila sekiz saat boyunca inkübe edin.

Extreme gene, nine reaktifini oda sıcaklığına, serumsuz besiyeri alikotunu ise 37 °C'ye getiriniz. Serumsuz besiyerini iki adet einor tüpüne pipetleyiniz. Ardından, einor tüpünün çeperine temas etmeden extreme gene nine reaktifini ekleyiniz ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe ediniz.

Bu süre zarfında, birinci tüpte 2D NA transfeksiyon karışımlarını hazırlayın; ikinci tüpe ran vanilla firefly ve boş bir vektör kontrolü ekleyin. Ran vanilla firefly ve moleküler şaperonu ekleyin. DNA'yı transfeksiyon reaktifi karışımına ekleyin, vorteksleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.

Bu karışımı plaklanmış hücrelerin üzerine eklemeye devam edin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Transfekte edilen hücreleri tripsin kullanarak hasat edin; altı kuyucuklu plakalarda %60 ila %70 konfluensle hücre ekimi yapın ve hücreleri gece boyunca inkübatörde bırakın. Transfekte edilen hücrelerin üzerindeki besiyerini aspire edin.

Ardından bir mililitre ısı şoku tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Denovo protein sentezini durdurmak için kapakları parafilm şeritlerle mühürleyin ve 45 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi parafilmi çıkarın ve hücreleri, belirlenen zaman noktalarında geri kazanım sağlamak amacıyla tekrar inkübatöre yerleştirin.

Hücreleri hasat edin ve bir kez PBS ile yıkayın. Etkin bir hücre lizizi için hücre peletini sıvı azotta şok dondurun ve 200 µL seyreltilmiş pasif liziz tamponu ekleyin. Şimdi örnekleri üç kopya halinde paylaştırın; 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 30 µL hücre lizatı ekleyin.

Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için, şok uygulanmamış referans numunelerle başlayın. Ren lüsiferaz aktivitesini ölçmek için, 1 millimolar ATP ve 0,2 micromolar lüsiferin içeren taze 0,2 millimolar lüsiferaz glisin tamponu reaksiyon tamponu hazırlayın. 96 kuyuklu plakayı lüminometreye yerleştirin ve programı başlatın.

Wallach 1420 iş istasyonu. Birinci pompayı, 0.2 micromolar ezine reaksiyon tamponu içeren Falcon tüpüne yerleştirin. Menüden dispenser bakımı seçeneğini belirleyin ve birinci pompayı işaretleyin.

Plaka düzenini düzenlemek için fill seçeneğini belirleyin. Menüden seçeneği, protokolü ve sonuçları keşfedin. Protokolü seçin.

Şimdi okunacak kuyucukları seçin. Wallach yöneticisine geri dönün ve örnek emisyonlarını ölçmek için başlat'a tıklayın. 482 nanometrede, dağıtıcı bakımına geçin; tüm kalıntı çözeltiyi tüpe geri göndermek için boşalt ve pompalama seçeneğini seçin.

Şimdi tüpü su içeren bir falcon tüpüne taşıyın ve yıkayın. Boş seçeneğini seçerek devam edin. Ardından, birinci pompadaki tüpü reaksiyon tamponuna, ikinci pompadaki tüpü ise LUCIFERIAN çözeltisine yerleştirin.

Plaka düzenini değiştirin. Birinci pompa ve ikinci pompa için doldurmayı seçin. Dispenser bakım menüsünden protokolü seçin ve 560 nanometre dalga boyundaki ateş böceği lüsiferaz reaksiyonunu ölçmeye başlayın.

Tekrarlama işlemi sonunda; boşaltma, durulama ve boşaltma prosedürünü tekrarlayın. Birinci ve ikinci pompa için sonuçları Wallach 1420 Explorer'da görüntüleyin. Her deney bir analizle ilişkilendirilmiştir.

Kullanıcı adını, başlangıç ve bitiş tarihlerini girin ve sonuçları bir Excel dosyası olarak dışa aktarın. Analiz için protein yeniden katlanması, geri kazanım süresiyle doğrudan ilişkilidir. Bu deneyde, hücreler ısı şokundan sonra farklı zaman noktalarında değerlendirilir.

Moleküler şaperon yokluğunda ve varlığında. Beklendiği üzere, hem kontrol gruplarında hem de moleküler şaperon ile transfekte edilmiş hücrelerde, refolde olan lusiferaz yüzdesi uzayan geri kazanım süresiyle birlikte artmaktadır. Buna karşın, geçersiz bir veri seti, zaman ile refolding arasındaki korelasyon için düşük R kare değerleri sergiler.

Bu tekniği takiben, şaperonun enzimatik aktivitesinin inhibisyonu gibi ek soruları yanıtlamak için in vitro TPA'lar analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi proteinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Isı şokunun ardından bu işlemi gerçekleştiriyoruz.