Aort Halka Testi
24 Kasım 2009
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damarsal kan damarlarının çimlenme hem de doğal ve patolojik süreçleri ile ilişkilidir. Burada anjiyogenik potentiators ve inhibitörleri doğrudan kültür aort halkalar eklenecek sağlayan bir aort halka tahlil göstermektedir. Çimlenme ve neovessel akıbet aort halkaları 6-12 günlük bir süre içinde inceleyerek tespit edilebilir.
Aort halkası deneyinin genel amacı, kan damarlarının 3B bir matris içinde bütün fare aort parçalarından filizlendiği esnek bir deneysel sistem sağlamaktır. Bu, öncelikle fareden torasik aortun diseke edilmesi ve ardından çevrede kalan dokulardan dikkatlice temizlenmesiyle gerçekleştirilir. Temiz aort dilimleri veya aort halkaları, her birinde kubbe şeklinde kalıplanmış bazal matris ekstraktı veya BME bulunan 48 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirilir.
Ek bir damla BME, halkayı 3D bir yapıda çevreler. Matris, seçilen herhangi bir deneysel reaktifi içerebilir. Birkaç günlük inkübasyonun ardından, aort halkalarından damarların filizlendiği gözlemlenebilir ve test bileşiklerinin anjiyojenik potansiyeli değerlendirilebilir.
Merhaba, ben Be Sheva İsrail'deki Negative Beon Üniversitesi Klinik Biyokimya Bölümü'nde, Dr. E Lewis'in laboratuvarından Karen Bein. Bugün sizlere fare aort halkası deneyi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, çeşitli maddelerin kan damarı oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.
Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bazal membran matrisi özütü veya BME'nin buz üzerinde veya dört santigrat derecede çözülmesini bekleyin. Çözündükten sonra, BME'nin tekrar katılaşmasını önlemek için soğuk tutmaya devam edin.
Deney gününde, altı ila yedi haftalık bir fareyi standart ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile ötanize edin; boyun arterleri üzerinden hızlıca kan alın ve ardından servikal dislokasyon uygulayın. Prosedüre, steril bir laminar akışlı kabin içerisinde hayvanı %70 ethanol ile silerek başlayın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, steril pens ve diseksiyon makası kullanarak ciltte dikey bir insizyon yapın ve peritonal duvarı açın.
Göğüs kafesinin kesildiği ve diyaframın çıkarıldığı üst sternumu açığa çıkarmak için insizyon yapılmalıdır. Omurganın yanında yer alan torasik aortu tamamen açığa çıkarmak için tüm organlar dikkatlice kenara itilir; aort açığa çıktıktan sonra, aort ile omurga arasına ince steril pensler yerleştirilir. Pensler açılarak aort yatağından kademeli olarak kaldırılır ve torasik segment aortun geri kalan kısmından ayrılır.
Aort ayrıldıktan sonra, renal damarlara yakın olan uçtan başlayıp kalbe yakın bir noktada bitecek şekilde, aortu fareden ayırmak için keskin bir makas kullanın. Çıkarılan torasik aortu, soğuk steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Aort çıkarıldıktan sonra, iki adet steril pens ve bir binoküler mikroskop altında çalışarak aort halkaları hazırlanabilir.
Torasik aortu çevreleyen yağ dokusundan temizleyin. Aorta zarar vermediğinizden emin olun ve aortu yalnızca kenarlarından tutun. Dehidrasyonu önlemek amacıyla, temizleme işlemi tamamlanana kadar aortu PBS içeren Petri kabına defalarca daldırın.
Torasik aorta temizlendiğine göre, binoküler altında çalışarak bir cerrahi bıçak yardımıyla aortayı eşit şekilde bir milimetrelik halkalar halinde dilimleyin. Kesim yüzeyinin altına kılavuz olarak yerleştirilen bir cetvel kullanın; keskinliği korumak için yeni bir bıçak kullandığınızdan emin olun ve bıçağı zaman zaman değiştirin. Aortanın uç kısımları kullanılmaz. Her halkayı kestikten sonra, bir cımbız yardımıyla halkayı çok nazikçe soğuk PBS içeren yeni bir kaba aktarın.
Deneyin randomize edildiğinden emin olmak için tüm halkaları PBS içeren aynı plakaya yerleştirin. Aortun her segmenti biraz farklı anjiyojenik potansiyele sahip olduğundan, halkaları buz üzerinde tutun. Ardından, önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak deney plağını hazırlayın.
48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, hareket sırasında kubbe şeklinde katılaşacak şekilde yaklaşık 150 µL soğuk BME ekleyin. BME; maddelerin taşınmasına, hücrelerin kemotaksisine ve en önemlisi, neo damar oluşumuna yol açan hücre farklılaşması ve migrasyonuna olanak tanır; çevre kuyucuklar PBS ile doldurulur. BME'nin dehidrasyonunu önlemek için BME damlasının 37 °C'de 20 ila 30 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. BME katılaştıktan sonra, hasarı önlemek için bir aort halkasını cımbız yardımıyla Petri kabından dikkatlice kaldırın; halka, cımbız uçları arasında oluşan lipid damlasının içine transfer edilmelidir. Sıvı yüzey gerilimi sonucunda, her kubbenin üst orta kısmına tek bir aort halkası yerleştirin ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Her halkanın üzerine ek olarak 150 µL BME ekleyin ve 20 ila 30 dakika inkübe edin.
37 °C'de, halka şu anda BME ile kaplanmış durumdadır ve analiz aşamasına geçilir. Analizi başlatmak için plakaya materyaller eklenebilir. Daha önceden hazırlanmış insan endotel serumsuz ortamı, deneysel materyal ile veya negatif kontrol için endotel hücre büyüme takviyesi ile destekleyin.
Sadece besiyeri kullanın. Her kuyucuğa 500 µL pres takviyeli besiyeri ekleyin ve 37 °C'de 6 ila 12 gün boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca, plakayı mikroskop altında inceleyerek aorttan filizlenen damarları ve daha fazla dallanan damarlarla tanımlanan ileri düzey olgun damarları gözlemleyin.
Halka dokusundan dışarıya doğru uzamayı standart faz kontrastlı stereoskop altında 6. ve 12. günler arasında üç boyutlu olarak fotoğraflayın. Ek olarak, 6. ve 12. günler arasında çeşitli günlerde süpernatanları toplayın ve bir gün içinde kullanmak üzere 4 °C'de veya gelecekteki kullanımlar için -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Süpernatanlar, vgf için ELISA veya nitrik oksit seviyeleri için Griess deneyi gibi çeşitli tekniklerle analiz edilebilir.
Bu görüntüler, halkaların kuyucuklara yerleştirilmesinden ve üst sıradaki görüntülerde görülen kültür ortamı veya alt panelde damar filizlenmesi için pozitif kontrol olarak kullanılan ECGS ile inkübasyondan 12 gün sonra toplanmıştır. Her görüntü, her koşul için analizde tipik olarak kullanılan 12 halkanın dördünü temsil eden bir anlık görüntüdür.
Her bir ayrı kuyucuktaki her bir aortik halkanın köşesi siyahtır. Bu şekilde fotoğraflandığında, ECGS'ye maruz bırakılan aortik halkalar damar büyümesi sergiler ve oklar, oluşmuş olan çok sayıdaki damardan birkaçını göstermektedir. Her bir damar, olgun olduklarını gösteren ara sıra dallanmalar içeren endotelyal hücre zincirleri ile karakterize edilir.
Kültürde herhangi bir filizlenme kabı gözlemlenemez. Üst paneldeki ortam kuyucukları; bu prosedürü uygularken aortik cor analizinin nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk. Doğru şekilde çalışmaya ve koşulların altındaki detayları anlamaya önem vermek gerekir.
İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kontrollü bir ortamda fare aortasından kan damarlarının filizlenmesine izin vererek anjiyogenezi incelemek için tasarlanmış bir aort halkası testi sunmaktadır. Bu test, anjiyojenik bileşiklerin doğrudan eklenmesine olanak tanıyarak, günlerce süren bir zaman dilimi boyunca yeni damar büyümesi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Anjiyogenez
- Vasküler biyoloji
- Deneysel analizler
Arka Plan
- Anjiyogenez, hem fizyolojik hem de patolojik süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Aort halkası deneyi, kan damarı oluşumunu incelemek için bir model sunar.
- Anjiyogenezin anlaşılması, çeşitli hastalıklara dair içgörüler sağlayabilir.
- Deney, farklı bileşiklerin 3D bir matris içerisinde test edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Anjiyogenezi incelemek için esnek bir sistem geliştirmek.
- Anjiyogenik potansiyel artırıcıların ve inhibitörlerin etkilerini değerlendirmek.
- Aort halkalarından damar filizlenmesini in vitro ortamda gözlemlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerden torasik aortun diseksiyonu.
- Aort halkalarının hazırlanması ve 3D matrise yerleştirilmesi.
- Aort halkalarının deneysel reaktiflerle inkübasyonu.
- 6-12 gün boyunca neovessel çıkımının gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Aortik halkalardan kan damarlarının başarılı şekilde filizlenmesi.
- Çeşitli bileşiklerin anjiyojenik potansiyelinin değerlendirilmesi.
- Deney yönteminin farklı deneysel koşullara olan esnekliğinin gösterilmesi.
- Anjiyogenez mekanizmalarına dair içgörüler.
Sonuçlar
- Aortik halka deneyi, anjiyogenez çalışmalarında değerli bir araçtır.
- Kontrollü bir ortamda anjiyojenik faktörlerin doğrudan test edilmesine olanak tanır.
- Bulgular, vasküler gelişim ve ilgili hastalıkların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Aort halkası deneyi, erken keşif aşamasında anjiyojenik ve anti-anjiyojenik bileşiklerin değerlendirilmesi için fizyolojik olarak ilgili organotipik bir model sunar. Nicelikle belirlenebilir neovessel büyümesiyle birlikte 3D bir matris içinde doğrudan bileşik testine olanak tanıyarak, vasküler hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasını ve yolak validasyonunu destekler. Bu deney, in vitro endotelyal taramalar ile in vivo modeller arasında köprü kurarak kardiyovasküler, onkoloji ve iskemik hastalık programları için lider bileşik belirlemede öngörülebilir güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bozulmamış aortik dokudan meydana gelen filizlenmeler üzerindeki bileşik etkilerini değerlendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Yerli bir vasküler eksplant sistemi kullanarak anjiyojenik hedeflerin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilişkili bir bağlamda damar oluşumu üzerinde ölçülebilir etkileri olan bileşikleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Anjiyojenik modülatörlerin doz-yanıt taraması için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Faz-kontrast görüntüleme ve biyobelirteç analizi için süpernatan toplanması yoluyla okumaları standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Biyolojik değişkenliği gidermek ve analiz sağlamlığını güvence altına almak için koşul başına 6 replikatlı testi destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Murin aort kullanımıyla hastalıkla olan ilgiyi korur ve in vivo benzeri anjiyojenik yanıtları yansıtır.
- Operasyonel Değer: Yeni damar oluşumunun boylamsal izlenmesine olanak tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Risk Azaltma: Tekrarlarda tutarlı pro- veya anti-anjiyojenik aktivite gösteren bileşiklerin belirlenmesi yoluyla ilerleme kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, biyokimyasal ve hücresel analizleri tamamlayan fonksiyonel bir okuma sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Bileşik uygulamalarını damar filizlenmesi ve olgunlaşmasındaki fenotipik değişikliklerle ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Konumsal yanlılığı en aza indirmek için standardize edilmiş BME gömme ve randomize halka yerleşimi yoluyla analiz hazırlığına olanak tanır.
- Analitik: Filiz uzunluğu/dallanmasının görüntü analizi ve süpernatantlardaki anjiyojenik faktörlerin ELISA tabanlı ölçümü aracılığıyla kantitatif çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Anjiyojenik yanıtları doku bağlamlı bir sistemde modelleyerek preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Vasküler patolojiyi içeren terapötik alanlardaki çeşitli bileşik kütüphanelerinin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Yerli dokudan neovessel oluşumu üzerindeki doğrudan etkileri gözlemleyerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış halka hazırlığı, BME kubbeleştirme ve tekrarlı testler aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Vasküler aktivitenin erken fenotipik doğrulamasını sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin anjiyojenik etkinlik ve özgüllüğe göre riskten arındırılmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Steril koşullar altında fare diseksiyonu ve doku işleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kubbe oluşumu için BME kalitesinin tutarlılığına ve 37°C'de uygun jelleşmeye bağlıdır.
- Gözlemci değişkenliğini minimize etmek için standartlaştırılmış görüntüleme protokolleri ve kör analiz gerektirir.
- Sulu ortamdaki çözünürlük ve stabiliteye bağlı olarak bileşik dozajının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonunu içerir.
- Aort segmentleri arasındaki biyolojik değişkenlikle sınırlıdır ve istatistiksel güvenilirlik için tekrarlı testler gerektirir.
