Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif ^{13 C-etiketleme}

Bu protokolün amacı, karbon 13 destekli metabolizma analizi kullanarak bakteriyel metabolizmayı incelemektir. Başlangıçta, mikroplar, mikrobiyal proteinlere dahil olan işaretli karbon substratlarının varlığında yetiştirilir. Ardından mikroplar hasat edilir ve amino asitler ekstre edilip hidrolize edilir ve türevlendirmeye tabi tutulur.

Numuneler bir gaz kromatografı ve kütle spektrometresine veya GCMS'e uygulanır. Biyokimyasal ağdaki metabolitler arasındaki atom geçiş yolları takip edilerek, mikrobun kullandığı fonksiyonel metabolik yollar belirlenebilir. Ben Bert Burla.

Burada sunduğumuz yöntem, mikroplardaki metabolik yolakların belirlenmesinde transkriptomik ve proteomiğin tamamlayıcısı olarak kullanılabilir. Bu tekniği, siyanobakteriler gibi fotosentetik mikropların miyotrofik veya heterotrofik karbon kullanımını araştırmak için kullandık. Bu videoda, yeni enzimatik fonksiyonların keşfi için işaretli karbon substratlarının kullanımını göstermek amacıyla model suş olarak ANOTHE 5 1 1 42'yi kullanacağız.

Prosedürü ben, li Yu ve Chu Yang Fang gerçekleştireceğiz. Bu prosedüre, cyana thesei bakterilerini etiketsiz bir besiyerinde büyüterek başlayın. Bakteriler orta logaritmik büyüme evresine ulaştığında, hacimce %3 oranında karbon 13 işaretli besiyerine inoküle edin.

Ardından, başlangıçtaki inokulum alt kültüründen gelen etiketlenmemiş karbonun, logaritmik büyüme fazının ortasında aynı etiketli ortama karışmasını önleyin. Karbon 13 ile etiketlenmiş Cy Thesei bakterileri logaritmik büyümenin orta evresine ulaştığında, santrifüjasyon ile 10 mililitre hacminde örnek toplayın. Pelleti 1,5 mililitre altı molar hidroklorik asit içinde yeniden süspande edin ve şeffaf cam vidalı bir gaz kromatografisi veya GC şişesine aktarın.

Biyokütle proteinlerini amino asitlere hidrolize etmek için flakonların kapaklarını kapatın ve 24 saat boyunca 100 °C'lik bir fırında bekletin. Biyokütle peletlerinin hidrolizi, yaygın 20 amino asidin 16'sını verir. Hidroliz sonrası, amino asit çözeltisini iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ardından beş dakika boyunca 20,000 G'de santrifüjleyin. Hidroliz sonrası, katı partiküllerin çöktürülmesi için amino asit çözeltisini iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ardından beş dakika boyunca 20,000 G'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, hidroliz çözeltisindeki katı partiküllerin GC kolonuna girmesini önlemek amacıyla süpernatantları yeni GC viallerine aktarın. Ardından, amino asitler gaz kromatografisi ile ayrıştırılabilmeleri için uçucu hale getirilecek şekilde kurutulur. Kurutulmuş örnekleri 150 µL tetrahidrofuran (THF) ve 150 µL N-butyl dimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide ile çözün.

Acetamide, T-B-D-M-S türevlendirme reaktifi ile tüm örnekleri 65 ile 80 °C arasındaki bir fırında bir saat boyunca inkübe edin. Şişedeki metabolitlerin çözündüğünden emin olmak için örnekleri ara ara vorteksleyin. Örnekleri 20.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatantı yeni GC şişelerine aktarın.

Süpernatant berrak sarımsı bir çözelti olmalıdır. GC sıcaklıkları şu şekildedir; iki dakika boyunca 150 °C'de tutun. Dakikada üç °C artışla 280 °C'ye yükseltin.

Sıcaklığı dakikada 20 °C artışla 300 °C'ye yükseltin ve ardından beş dakika boyunca sabit tutun. Daha sonra 30 m'lik bir GC kolonu için solvent geciktirmesini yaklaşık beş dakika olarak ve kütle/yük oranı aralığını 60 ile 500 arasında ayarlayın. Örnekleri, 1:5 veya 1:10 split oranında 1 µL enjeksiyon hacmi ve 1,2 mL/dk helyum taşıyıcı gaz akış hızı kullanarak GCMS ile analiz edin.

GCMS verilerini Microsoft Excel kullanarak analiz edin. Her bir amino asit için GC alıkonma süresi ve kendine özgü kütle/yük oranı pikleri bu şekilde gösterilmiştir. T-B-D-M-S türevli amino asitler, MS ile genellikle iki yüklü fragmana net bir şekilde ayrılır: amino asidin tamamını içeren M eksi 57 fragmanı ve lösin ile izölösin için amino asidin alfa karboksil grubundan yoksun olan M eksi 159 fragmanı.

M minus 57 piki, diğer kütle piki fragmanları ile örtüşmekteydi. Tüm amino asit etiketlemesini analiz etmek için N minus 15 kullanılabilir. Ayrıca, çoğu amino asitte genellikle F 3 0 2 grubu tespit edilir ve bu grup yalnızca amino asit omurgasındaki ilk alfa karboksil grubunu ve ikinci karbonları içerir.

Bununla birlikte, bu Ms.Peak genellikle yüksek gürültü-sinyal oranlarına sahip olduğundan, metabolik akıların kantitatif analizi için F 3 0 2 önerilmez. Amino asitlerin veya merkezi metabolitlerin türevlendirilmesi; karbon 13, oksijen 18, silikon 29 ve silikon 30 dahil olmak üzere önemli miktarlarda doğal olarak etiketlenmiş izotopların girişine neden olur. Ham kütle izotop veya spektrumundaki doğal izotoplardan kaynaklanan ölçüm gürültüsü, yayınlanmış yazılımlar kullanılarak düzeltilebilir.

Nihai izotopik işaretleme verileri kütle fraksiyonları olarak raporlanmıştır. Örneğin, sıfırdan dörde kadar karbon 13 işaretli karbon içeren fragmanları temsil eden M sıfır, M1, M iki, M üç ve M dört. Bu 5 1 1 2, tipik isle sentez yolakında treoninle 2-ketobütirat arasındaki dönüşüme katalize eden enzim treonin amonyak liyazı içermemektedir.

Bu nedenle, bu organizmadaki izole yolunu belirlemek için, cyana THESEI 5 1 1 42, 54 millimolar gliserol içeren ASP two ortamında büyütülmüş ve bu videoda burada gösterildiği üzere GCMS ile analiz edilmiştir. Cyana Thesei 5 1 1 4 2, ana karbon kaynağı olarak ikinci konumdan işaretlenmiş gliserolü kullanır; öncülü piruvat olan thianine ve alaninin bir işaretli karbona sahip olduğunu, ISO lösinin ise üç karbonla işaretlendiğini gözlemledik. Dolayısıyla, cyana these 5 1 1 4 2'de sentez, çoğu organizma tarafından kullanılan thianine yolundan türetilemez. Öte yandan, lösin ve ISO lösin, M eksi 15 fragmanı ve M eksi 1 59 fragmanına dayanarak özdeş işaretleme modellerine sahiptir.

Örneğin, parçalanmamış amino asitler içeren N-15 izotopu veya verileri, lösin ve izölösin için özdeş işaretleme göstermiştir. Bu nedenle, lösin ve izölösin aynı öncüllerde olan piruvat ve asetil-CoA'dan sentezlenmelidir. Bu gözlem, izölösin sentezi için sitramalat yolundaki işaretli karbon geçişi ile tutarlıdır.

Bu yöntem, çok çeşitli mikropların metabolizmasını incelemek için kullanılabilir ve yönteme hakim olunduğunda, başlangıçtan bitişe kadar yaklaşık bir hafta içinde tamamlanabilir.