Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Bu gösterim, 3D bir matris içindeki canlı hücrelerde floresan işaretli proteinlerin görüntülenmesini amaçlamaktadır. İlk olarak, floresan işaretli proteinler eksprese eden stabil hücre hatları oluşturun. Bu hücreleri 3D kolajen matrise ekleyin, ardından konfokal mikroskop kullanarak göç eden hücrelerin zaman ayarlı görüntülerini edinin.

Nihayetinde sonuçlar, zaman ayarlı görüntüleme ve FP analizi aracılığıyla göç eden hücreler içindeki protein lokalizasyonunu ve dinamiklerini aydınlatarak, protein dinamiklerinin ve lokalizasyonunun 3D ve gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlar. Bu yöntem, hücre göçündeki temel soruların yanıtlanması için bir yol sunar. Örneğin, yapışma temasları sitoplazmik proteinler tarafından nasıl düzenlenir?

Ayrıca, bu temasların spesifik inhibitörler tarafından nasıl bozulduğu da incelenir. P 35 kapta %80 ila %90 konfluens düzeyindeki hücreleri, üretici talimatlarına uygun olarak Lipo 2000 kullanarak ilgili plazmid ile transfekte edin. Ardından hücreleri bir inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, hücreleri iki adet P one 50 Petri kabına bölün ve gece boyunca inkübe edin. Ortama 50 µg/mL G four 18 ekleyerek besiyerini tazeleyin. Kültürlemesine iki hafta boyunca antibiyotik seçimi altında devam edin.

Kültürü G dört 18 dirençli koloniler açısından inceleyin. Ardından, ters floresan mikroskobu kullanarak GFP pozitif kolonileri tanımlayın ve işaretleyin.

Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamanın ardından, işaretlenmiş her koloni için hücrelerin kurumasını önlemek amacıyla ince bir sıvı tabakası bırakın. Steril bir pamuklu çubukla kenarların etrafını mümkün olduğunca yakından silin ve koloninin üzerine 10 µL tripsin pipetleyin.

Her koloni için işlemi hızlıca tekrarlayın. Ardından, hücrelerin ayrışması için plakayı 37 °C'de inkübe edin. Mikroskop altında yuvarlak görünümü doğrulayın.

Her bir koloni üzerine 10 µL tripsin ekleyin ve hücreleri plakadan tamamen ayırmak için pipetleyin. Ardından, stabil kolonileri çoğaltmak için her bir hücre kolonisini 24 kuyucuklu bir kültür plağının tek bir kuyucuğuna aktarın. Sonrasında, kolonilerin protein ekspresyonunu standart western blot ve immünofloresan yöntemlerini kullanarak değerlendirin.

Seçilen hücre hatlarını genişletin, cam yüzeyi modifiye edin. Kabın tabanı optimal kolajen bağlanmasını sağlar. 10 mm açıklığa sahip her bir P 35 kabın cam kısmına 300 µL silizasyon çözeltisi pipetleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Solüsyonu aspire ederek uzaklaştırın ve filtre edilmiş su ile üç kez, her biri 10 dakika olacak şekilde yıkayın. Suyu uzaklaştırın ve kapları 50 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine 1,5 saat boyunca yerleştirin.

Kurumayı sağlamak için kapakları kapların üzerine hafifçe aralık şekilde yerleştirin. Kuruyan kaplar soğuduktan sonra, her bir kabın cam kısmına 300 µL %2'lik glutaraldehit çözeltisi pipetleyin. Bir saat boyunca inkübe edin ve ardından her biri 10 dakika sürecek şekilde 3 kez PBS ile yıkayın.

Kapları bir saat boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. İlk olarak, 100 µL floresan izleyici partikülü santrifüjasyonla çöktürün. Sıvıyı uzaklaştırın ve partikülleri 500 µL besiyerinde yeniden süspanse edin.

Beş kez yıkama işlemi gerçekleştirin, ardından partikülleri 30 µL besiyerinde yeniden süspande edin. Sonrasında, GFP eksprese eden hücreleri tripsin kullanarak toplayın ve bir eppendorf tüpünde mililitre başına 2 milyon hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın. 240 µL büyüme besiyeri pipetleyin. 12,6 µL 1 M HEPES, 20 µL filtrelenmiş su, 50 µL hücre solüsyonu ve 10 µL floresan partikül ekleyin.

Son olarak, 167 µL sığır dermis kolajeni ekleyin ve çözeltiyi iyice karıştırın. Şimdi, hazırlanan silanize kapla cam kısma 80 µL aktarın. Jel polimerleşmesi için 37 °C'de 50 dakika inkübe edin.

Ardından dikkatlice iki mililitre büyüme medyumu ekleyin. Hücre medyumunu yenilemek için mikroskop haznesini 37 °C sabit durum sıcaklığına dengeleyin. DIC görüntüleme için nötr pH'ı korumak amacıyla, kabın üst kısmını ince bir parafilm şeridi bulunan cam bir üstle değiştirin.

Yağ daldırma objektifi için buharlaşmayı önlemek amacıyla kabın yan tarafını kapatın. Objektif konumuna bir damla daldırma sıvısı damlatın. Kolajen jel içeren kabı, kap daldırma sıvısıyla temas edecek şekilde mikroskop tablasına yerleştirin.

Sahne kaymasını en aza indirmek için örneği odaklayın ve görüntülemek istediğiniz ilgili hücreleri arayın. Kabın yaklaşık 45 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın. Uzun süreli bir görüntüleme işlemine başlamadan önce, inhibitör ekleme deneyleri için görüntü elde etme parametrelerini belirleyin.

İstenilen çalışma konsantrasyonundaki ilaç ile desteklenmiş besiyeri hazırlayın. Nötr pH'ı korumak için hücre besiyerini yenileyin ancak perfil ile kapatmayın. Örneği mikroskoba aktarın ve ilaç uygulaması sırasında görüntüleme işlemine geçin.

Görüntüyü durdurun, kapağı yakalayın ve kabı sarsmadan dikkatlice çıkarın. Besiyerini aspire edin ve ilaç içeren besiyerini pipetle kabın içine aktarın. Ardından kabın kapağını dikkatlice tekrar kapatın.

Üst FRAP kurulumu sistemler arasında farklılık gösterir. Bu nedenle üretici talimatlarına başvurun. İlk olarak canlı hücre görüntüleme parametrelerini belirleyin.

Fotobleaching işlemi için. Hücreye zarar vermeden floresan sinyali fotobleach edecek yeterli lazer gücünü elde etmek için bu parametreleri deneme hücreleri üzerinde test edin. Ardından, örnek üzerinde en az beş kare alacak şekilde görüntü yakalamayı başlatın.

Ardından, ilgi bölgesini fotobleyç edin. Toparlanma süresi boyunca görüntü almaya devam edin. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak, fotobleyç işlemi öncesi ve sonrasındaki ortalama floresan yoğunluğunu zamanla ölçün.

Toparlanma eğrisini eksponansiyel denkleme uydurun. Eksponansiyel uyum eğrisinden yarılanma süresi ve final yoğunluğu parametrelerini elde edin. Ardından, final floresan yoğunluğunun başlangıç yoğunluğuna oranını alarak mobil fraksiyonu hesaplayın.

Bu 3D canlı hücre görüntüleri, GFP aktin eksprese eden sağlıklı epitel hücrelerini göstermektedir. Dört günlük kültürleme süresinin ardından, bu hücreler 3D kolajen matris içerisinde bir kist oluşturmuştur. Bazı hücreler kistin yüzeyi boyunca göç ederken, diğerleri kistin iç kısmında göç etmiştir.

Göç eden hücrelerin uyguladığı traksiyon kuvvetleri sonucunda meydana gelen matriks deformasyonu, çevreleyen matrise gömülü izleyici partiküllerin yer değiştirmesi aracılığıyla analiz edilir. RO kinaz inhibisyonunun traksiyon kuvveti üzerindeki etkisi burada gösterilmektedir. İzleyici partikül hareketleri, farklı zaman noktalarının maksimum projeksiyon görüntüsü olarak sergilenmekte ve her zaman noktası yalancı renklendirilmiştir.

Alternatif olarak, tek bir izleyici parçacığın görüntüleri, parçacığın hareketini göstermek amacıyla bir montaj şeklinde sunulmuştur. Zaman içerisinde bu izleyici parçacık, Y 2 7 6 3 2 eklenmesinden önce ve sonra sırasıyla göç eden hücrenin arka kenarına doğru yaklaşmış ve oradan uzaklaşmıştır. FRAP analizi, üç boyutlu bir matris içinde göç eden GFP aktin eksprese eden hücreleri takip ederek tipik floresans geri kazanımını göstermektedir. Optimize edilmiş lazer ayarlarında gerçekleştirilen bir fotoblokaj deneyinden sonra, hücrelerin sağlıklı ve hasarsız durumu korunurken, ilgi bölgesinin floresans yoğunluğu arka plan seviyesine kıyasla gözle görülür şekilde azalmıştır.

Bu grafik, geri kazanım eğrisinin eksponansiyel bir fonksiyonla uyumunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, hücrelerin matrise ekilmesi bir saat sürebilir. Üç amino propil trimetil ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, kimyasal çeker ocakta çalışmak gibi önlemler alın. Ayrıca, 3B matris içindeki hücrelerle çalışırken steril koşulları korumayı unutmayın.