Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, mikro sirkülasyonun non-invaziv ve etiketsiz bir şekilde görüntülenmesini sağlayan in vivo optik çözünürlüklü fotoakustik mikroskobi veya Pam yöntemini göstermektir. Bu işlem, öncelikle deney hayvanının anestezi altına alınmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, optik çözünürlüklü fotoakustik mikroskobun görüntüleme başlığı hareket ettirilerek ilgi bölgesinin konumlandırılmasıdır; ardından tarama parametreleri ayarlanır ve görüntüleme işlemi başlatılır.

Nihayetinde, toplam oksijen konsantrasyonu ve hemoglobinin oksijen satürasyonu dağılımları, çok dalga boylu deneysel verilerin hesaplanması yoluyla elde edilir. Optik çözünürlüklüle fotoakustik mikroskopi, lazer uyarımı ve ultrasonik saptamaya dayanır. Kısa bir lazer ışını biyolojik dokuya odaklanır.

Işık absorbsiyonu, geçici bir ısınma ve ardından görüntü oluşturmak için algılanan ultrasonik emisyon üretir. Fotoakustik mikroskobinin (PAM) benzersiz avantajı, temel olarak etiketsiz tespit yapabilmesi ve optik absorbsiyona karşı sahip olduğu yüksek hassasiyettir. Buna karşın, mevcut yansıma tabanlı optik mikroskopi teknolojileri öncelikle optik saçılmaya veya floresansa duyarlıdır. Optik absorbsiyonun in vivo, etiketsiz ve yüksek çözünürlüklü görüntülemesini sağlayabilen PAM; nöroloji, oftalmoloji, vasküler biyoloji ve dermatoloji alanlarında geniş biyomedikal uygulama alanları bulmuştur.

Optik çözünürlüklü fotoakustik mikroskopi veya PAMM, hem optik hem de ultrasonik bileşenlerden oluşur. Optik ışınlama kaynağı, katı hal darbeli lazer ile pompalanan bir boya lazeridir. Çıkış lazer ışını, bir nötr yoğunluk filtresi ile zayıflatılır ve çok modlu lazer ışınının tek modlu bir optik fibere etkili bir şekilde aktarılmasını sağlamak amacıyla, yaşayan nesne yerine mikroskop görüntüleme başlığının mekanik taramasına olanak tanımak için ışık iletimi için tek modlu bir optik fibere bağlanır.

Işık öncelikle 50 mikrometre çapında bir iğne deliği ile filtrelenir. İğne deliği, çapını temel mod ışın çapıyla eşleştirmek için kondanser lensin odağından hafifçe uzağa yerleştirilir. Difraksiyona yakın sınırlı bir optik odak oluşturmak için, tek modlu fiberin çıkışı kolime edilir ve bir mikroskop objektifinin arka açıklığını doldurur.

Ultrasonik tespit, bir ultrasonik transducer'a bağlı, ev yapımı bir akustik optik ışın birleştiricisi kullanılarak gerçekleştirilir. Birleştirici, optik ışınlamayı ve akustik tespiti eş eksenli olarak hizalar. Su içerisinde 0,5 sayısal açıklığa sahip bir akustik lens oluşturmak için birleştiricinin altına küresel bir oyuk açılmıştır; bu yapı, 50 megahertz merkez frekansında 43 mikrometre düzeyinde bir akustik odak çapı sağlar.

İlk hizalama için, akustik odak düzleminin konumunu belirlemek amacıyla puls-eko ultrasonun kullanılması faydalıdır. Görüntüleme başlığı, maksimum puls-eko ultrasonik sinyal gözlemlenene kadar dikey olarak ayarlanır. Algılama hassasiyetini maksimize etmek için optik ve akustik odak noktaları konfokal olarak hizalanır.

Siyah elektrik bandı parçası gibi optik olarak soğurucu bir hedef, akustik odak düzlemine yerleştirilir. Ardından, fotoakustik sinyali maksimize etmek için optik odak pozisyonu ayarlanır. PAM sistemi ayrıca elektronik amplifikatörler ve analog dijital dönüştürücü, mekanik bir tarayıcı ve bir tarayıcı kontrol cihazı da içerir.

Dijitalleştirilen sinyal, görüntü oluşturma amacıyla bir bilgisayara aktarılır. Yazılım, ham verileri bir dizi kesit tarama görüntüsüne dönüştürür. Mikroskop başlığı nesneyi raster tarama yöntemiyle tararken, kaydedilen görüntüler daha sonra bireysel kesit görüntüleri, 2D maksimum genlik projeksiyon görüntüleri veya 3D renderlamalar olarak görüntülenebilir.

Mikroskop görüntüleme başlığını yerleştirmek için bir su tankı kullanılır. Bir Petri kabına bir görüntüleme penceresi açılır ve ultrasonik ve optik olarak şeffaf bir polietilen membran ile kapatılır. Objekten yayılan fotoakustik dalga, önce obje ile polietilen membran arasındaki ultrasonik jel aracılığıyla ve ardından Petri kabındaki deiyonize su aracılığıyla ultrasonik dedektöre akustik olarak aktarılır.

Mevcut optik lazerlerin ve ultrason dönüştürücüsünün bu buluşları ve uygulamaları, or pam sistemini oluşturur. Bir sonraki bölümde, bu sistemle canlı bir farenin mikrodamar yapısını görüntüleyeceğiz. Görüntülenen hayvan nude fare değilse, deneyden 24 saat önce tıraş edilmesi idealdir.

Böylece cilt damar yapısındaki irritasyon giderilmiş olur. Fare, tıbbi sınıftaki oksijen içerisinde buharlaştırılmış %3 ISO fluorine ile anestezi altına alındı. Tipik akış hızı, dakikada 1 ile 1,5 litre arasındadır.

Hayvanın vücut ağırlığına bağlı olarak, deney boyunca %1 izofluran ile anesteziyi sürdürün; farenin tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkma testi yapın. Vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ısıtıcı ped içeren stereotaktik düzeneğe aktarın.

Şimdi kulağı plastik plaka üzerinde düzleştirin. Ardından kulağın üzerine bir tabaka ultrason jeli uygulayın. Jel içerisinde hava kabarcıkları kalmamasına dikkat edin.

Kurumayı veya yanlışlıkla oluşabilecek lazer hasarını önlemek için gözlere oftalmik pomad uygulayın. Uygulayıcının göze doğrudan temas etmesinden kaçının. Ardından kulağı görüntüleme penceresinin altına yerleştirin ve ultrason jeli membranın altına temas edene kadar hayvan tablasını yavaşça yükseltin.

Kulağın membrana bastırılmasının kulaktaki kan akışını etkileyebileceği nedeniyle yumuşak temas gereklidir. Ardından, hayvanın fizyolojik durumunu izlemek için birkaç önlem alın. Bir pulse oksimetreyi farenin bacağına veya kuyruğuna sabitleyin.

Şimdi, akustik lens deiyonize suya daldırılana kadar görüntüleme kafasını indirin ve akustik lensin altında hapsolmuş kabarcıkları giderin. Lazeri harici tetikleme moduna ayarlayın ve deneme taramasına başlayın. Optik ve akustik çift odak noktaları kulağın ortasına yerleşene kadar görüntüleme kafasının Z konumunu ayarlayın.

Şimdi tarama parametrelerini ayarlayın ve resmi veri toplama işlemini başlatın. Toplam hemoglobin konsantrasyonunu ölçmek için dalga boyunu, oksigemoglobin ve deoksigemoglobinin eşit molar sönümleme katsayılarına sahip olduğu bir ISO izosbestik noktaya ayarlayın.

Hemoglobin oksijen saturasyonunu ölçmek için, ikinci dalga boyunu oksihemoglobin ve deoksihemoglobinin molar sönüm katsayılarının belirgin bir fark gösterdiği değere ayarlayın. İşlem tamamlandığında, fare kulağını temizleyin ve fareyi bir inkübatöre yerleştirin. Ortam sıcaklığı 37 °C olarak ayarlandığında, fare uyandıktan sonra onu doğal olarak hayvan tesisine geri götürün.

Bu maksimum genlik projeksiyon görüntüsü, 570 nanometrede o-Pam kullanılarak görüntülenen canlı bir nude fare kulağının vasküler anatomisini göstermektedir. Bu projeksiyon görüntüsü, aynı kulaktaki hemoglobin oksijen satürasyonunu göstermektedir. Bu değer, 570 nanometrelik bir izosbestik dalga boyunda ve 561 nanometrelik deoksihemoglobin absorbsiyon baskın bir dalga boyunda elde edilen görüntülerden hesaplanmıştır.

Kutulu bölgeye daha yakından bakıldığında oramm çözünürlüğü görülmektedir. Yoğun bir kapiller yatak açıkça ayırt edilebilmektedir. Bu videoda; sistem konfigürasyonu, sistem hizalaması, in vivo deneysel prosedür ve fonksiyonel görüntüleme şeması dahil olmak üzere ORPM için tipik deneysel protokolü gösterdik.

Cihaz tasarımı ve çalışmasındaki en önemli hususlardan biri, görüntüleme hassasiyeti ve optik çözünürlük için kritik öneme sahip olan optik akustik konfokal hizalamadır. Derin nüfuz eden akustik çözünürlüklü fotoakustik mikroskopi ve fotoakustik bilgisayarlı tomografi ile kombinasyon halindeki fotoakustik mikroskopi; in vivo, fonksiyonel ve moleküler görüntülemenin yanı sıra birden fazla ölçekte, organellerden hücrelere, dokulardan organlara kadar aynı kontrastla görüntüleme yapma vaadi sunmaktadır. Bu tür bir görüntüleme ölçeklenebilirliği, mikroskobik laboratuvar keşiflerinden makroskobik klinik uygulamalara kadar, çok ölçekli sistem biyolojisi ve translasyonel araştırmalarda devrim yaratma potansiyeline sahiptir.