Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Mass squirm protokolü, izotopik metilasyon ve MALDI kütle spektrometrisi kullanarak lizin demetilaz aktivitesini nicelleştirmeyi amaçlar; öncelikle metillenmiş lizin içeren peptitler üzerinde enzim katalizli demetilasyon reaksiyonları gerçekleştirilir. Ardından, demetilaz reaksiyonunun peptit ürünleri, MALDI ile aynı şekilde iyonize olan tekdüze metillenmiş peptitler üretmek için döteryumlanmış formaldehit ile kimyasal olarak metillenir; ardından her bir peptit türü MALDI kütle spektrometrisi ile nicelleştirilir ve izotopik örtüşmeler hesaba katılır. Metillenmemiş, mono, di ve trimetil peptitlerin bağıl miktarlarını belirlemek için mass squirm sonuçları, kütledeki değişimlere dayanarak her bir demetilaz reaksiyon ürününün bağıl miktarlarını belirler.

Bu tekniğin rutin kütle spektrometrisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kütle skorunun farklı şekilde metillenmiş peptitler arasındaki iyonizasyon farklarını hesaba katmasıdır. Bu yaklaşıma dair ilk fikri, izotopik olarak ağır asetik anhidrit kullanarak histon asetilasyon seviyelerini ölçmek için bir yöntem geliştirdiğimizde edindik. Bu tekniğin zorluğu, peptit izotopik zarflarının örtüşmesi nedeniyle karmaşıklaşabilen pik alanı verilerinin çıkarılmasıdır.

Demetilaz reaksiyonu için, 20 µL nihai hacmindeki demetilaz tamponunda 125 ng rekombinant lizin spesifik demetilaz bir enzimi ile 0,25 µg biotinillenmiş dimetil histon H3 peptidini birleştirin. Ayrıca, LSD1 enzimi içermeyen 0,25 µg peptit içeren bir kontrol numunesi hazırlayın; reaksiyon ve kontrol tüplerini 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, R2 20 µm gözenekli boncukları hazırlamak için eşit hacimlerde boncuk ve metanolü karıştırın.

Ardından 10 hacim TFA formik asit ekleyin, her örneğe sekiz mikrolitre gözenekli boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çalkalayın. Bu sırada, iki adet C 18 zip tipini koşullandırın. 20 mikrolitre %0,1 TFA ile iki kez, %70 asetonitril %0,1 TFA ile dört kez ve tekrar %0,1 TFA ile dört kez pipetleyin.

Ardından, iki örneği koşullandırılmış zip tip uçlarına yükleyin. Bir pipet yardımıyla, hacmi C 18 reçinesinden geçirin. Her iki örneğin toplam hacmi zip tip uçlarından geçene kadar işlemi tekrarlayın.

Ardından zip uçlarını iki kez 20 µL %0.1 TFA ile yıkayın; örnekleri 40 µL elüsyon tamponu ile elüe edin ve bir speed vac konsantratör ile tamamen kurutun. İlk olarak örneği 100 µL 50 mM pH 7.4 fosfat tamponunda yeniden süspande edin. Sonra sekiz µL borodimetilamin ve 16 µL dereadyal formaldehit ekleyin.

Dört °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Boran dimetilamin ve döteryumlanmış formaldehit ekleyerek redüktif metilasyonu tekrarlayın ve iki saat boyunca inkübe edin. Üçüncü seferde, boran dimetilamin ekleyin ve dört °C'de 15 saat boyunca inkübe edin.

Reaksiyonu 12,5 µL 1 M Tris (pH 7,4) ile durdurun. SpeedVac konsantratör kullanarak tamamen kurutun. Ardından, kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerini 100 µL 50 mM fosfat tamponu (pH 7,4) içerisinde yeniden süspanse edin.

Şimdi kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerine sekiz µL gözenekli boncuk ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi zip tip uçlar üzerinde toplayın. İki µL'lik hacimler halinde MALDI örnek plakasına elüye edin ve oda sıcaklığında kristalleşene kadar kurumaya bırakın. Örnekleri kütle spektrometrisi ile analiz etme aşamasına geçin.

Spektro dosyalarını çalışma yazılımında açın ve M over Z yazılımına aktarın. Reaksiyon ürünlerini tandem kütle spektrometresi ile ayrıca doğrulayın. İlk olarak, kontrol örneği için karbon 13 C iki ve karbon 13 C dört izotoplarının mono izotopik pikiyle olan pik alanı oranını belirleyin.

Her bir modifikasyonda bulunan peptitlerin göreceli miktarını belirlemek için bu hesaplanan oranları kullanın. Demetilaz reaksiyon örneğinin durumu. LSD tek enzimi, lizin demetilasyonunun kütle tayini miktarlandırmasında etkili bir şekilde kullanılabilir.

Kontrol reaksiyonu redüktif metilasyona uğramadığı için, bu peptid için tipik izotopik zarfı gösterir. Ortaya çıkan pik alanları, karbon 13 C iki ve karbon 13 C dört formunda mevcut olan peptidlerin arka plan oranlarını belirler. İzotopik durumlar ve kontrol reaksiyonu için kütle spektrumundan elde edilen pik alanları, her bir modifikasyon durumunda bulunan peptid miktarının göreli nicemlemesine olanak tanır. Demetilaz reaksiyonunda, bu kontrol ve demetilaz reaksiyonlarından elde edilen pik alanları %33,7 dimetil lizin 4, %42,0.3 monometil lizin dört ve %24le metillenmemiş lizin dört olduğunu belirler.

Bu kütle spektrometrisi yaklaşımı, histon lizin kalıntılarının demetillasyonunun çeşitli hastalıklara nasıl katkıda bulunduğu gibi histon epigenetiği alanına dair temel bilgiler sunmaktadır. Bu metilasyon analizi demetilazları incelemek için uygulanmış olsa da, metil transferazların incelenmesinde de kullanılabilir.