Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

Bu prosedürde, parazitlerin dalaktan geçiş dinamiklerini değerlendirmek için kullanılan Kantitatif intravital mikroskopi yaklaşımını gösteriyoruz. Bir kemirgen sıtma modelinde, GFP transgenik parazitler ile enfekte edilmiş fareler, dalak intravital mikroskopisi için hazırlanır; dalak ven kanülasyonu, intravital boyaların enjekte edilmesine olanak tanır. Deney sırasında, floresan işaretli hücrelerin dalağın farklı bölgelerindeki hareketleri görüntülenir.

Kırmızı pulpanın üç boyutlu yavaş kompartmanındaki parazit hareketliliğini tanımlamak için gerekli metodolojiyi sunuyor ve damar kan akışını hesaplıyoruz. Bu parametreler, iki PULE suşunun dalak dinamiklerini karşılaştırmak için kullanılmıştır. Herkese merhaba.

Benim adım Nando El Portillo ve laboratuvarımdaki temel araştırma sorularından biri, sırtın sıtmadaki rolünü anlamaya çalışmaktır. Splenomegali bu hastalığın belirgin özelliklerinden biridir, ancak teknik ve etik sorunlar nedeniyle bu organ üzerine çalışmalar yürütmek oldukça zordur. Bunu başarmak için, bu parazitin dinamik geçişini görmemize ve bu olayı nicelleştirmemize olanak tanıyan teknolojiler geliştirdik.

Lorena ve MI bu protokollerde bunları açıklayacaklar. Bu araştırma, kısmen Almanya'daki Hamburg Üniversitesi'nden Dr. Ler'in grubu ve buradaki hastane kliniğinden Dr. Maria Kbo'nun grubu ile iş birliği içinde yürütülmekte olup Cellex vakfı ve İspanya'daki CIA bakanlığının genel finansman desteğini almıştır. Enfeksiyon, %10 parazit oranında, letal veya non-letal GFP parazitleri ile enfekte edilmiş Donör M'den başlatılır. Parazit kontrolü için farenin kuyruk veninden küçük bir damla kan alınarak mikroskoba yayılır.

GIM çözeltisi ile kolometrik boyama lamı hazırlayın. Bir çözelti, kurutulduktan sonra enfekte kırmızı kan hücrelerinin görselleştirilmesine olanak sağlayacaktır; kan yaymasını iki dakika boyunca Metanol ile sabitleyin, GIM çözeltisini uygulayın ve 20 dakika inkübe edin. Lamı akan musluk suyu ile yıkayın ve kurutun; 100x yağlı objektife sahip bir ışık mikroskobu kullanarak toplam RBC'ler üzerinden pbcs yüzdesini sayın.

Donör farelerin kuyruk kanından alınan ve PBS ile seyreltilen letal veya non-letal parazitlerle fareleri enfekte edin. Enfeksiyon sonrası üçüncü günde %1'lik bir periferik parazit düzeyine ulaşmak amacıyla, fare başına yarım milyon parazit enjekte edilecek şekilde dozu ayarlayın ve intraperitonal olarak enjekte edin. Alternatif olarak, kontrolde FITC işaretli RBC'ler kullanılabilir.

Hayvanlardan bir mililitre arteriyel kan toplanır ve pellet, EDTA içeren PBS ile santrifüjleme yoluyla yıkanır, FITC çözeltisi içinde yeniden süspanse edilir ve hafif ajitasyonla karanlıkta iki saat boyunca inkübe edilir. Bu sürenin sonunda, süpernatant santrifüjle uzaklaştırılır ve kapsamlı bir şekilde yıkanır. Periferik dolaşımda ortalama %1 konsantrasyon sağlayacak şekilde bir kontrol fareye enjekte edilir ve in vivo deneylere geçilir.

Merhaba, ben mija. Dalak görüntülemesini in vivo olarak gerçekleştirmek için, dalağı açığa çıkarmak amacıyla hayvana küçük bir cerrahi işlem uygulamamız gerekiyor; elbette bu tekniği, teşekkür etmek istediğim worker Heisler laboratuvarından Stephanie GR'dan öğrendim ve şimdi size nasıl ilerleyeceğinizi göstereceğim.

Enfekte miyozun görüntülemesi, her iki suşta da parat %1 olduğunda, enfeksiyon sonrası üçüncü günde gerçekleştirilmiştir. Fareyi prosedür boyunca anestezi altında ve düzenlenmiş sıcaklıkta tutun. Gözleri nemlenmeden koruyun ve maddelerin intravenöz uygulamasını kolaylaştırmak için işleme başlamadan önce ayak tabanına dokunarak farenin tamamen anestezi altında olduğunu doğrulayın.

Deney süresince, kanülü oluşturmak için fare kuyruk venine kanülasyon yapın. Bir tüpün bir ucuna küçük bir iğne, diğer ucuna ise aplikatörünü yerleştirin. Kanülü, hava kabarcıklarını gidererek fizyolojik salin ile doldurun ve solüsyonun kanül boyunca doğru şekilde aktığını kontrol edin.

Kuyruğun lateral venine temiz bir şekilde kanülasyon yapılacaktır. Kuyruk tabanında hafif bir sıkıştırma yaparak venin görünürlüğünü artırın. Kanülün ucunu venin içerisine yerleştirin.

Kan gelmesi, iğnenin doğru konumlandığını gösterecektir. Eğer konumlandırma doğru değilse, kanülasyon işlemini venin daha proksimal bir noktasında tekrarlayın, ardından kanülü kuyruğa yapıştırıcı ve bant kullanarak sabitleyin. Hayvanın sol dorsal tarafındaki deri ve kas dokusunda yapılacak küçük bir insizyon ile dalağın alt kısmını açığa çıkarın.

Daha az solunum hareketinin gözlemlendiği bir yere dalak yerleştirin ve fare tüylerinden temiz tutmak ve nemli kalmasını sağlamak için açığa çıkan yüzeye PBS uygulayın. Görselleştirme sağlamak için dalağı bir örtü camı ile kapatın. Merhaba, benim adım Lorena.

Gösterilen protokol, PULI parazitlerinin dalak üzerindeki hareketini görselleştirmemizi sağlayacaktır. Bu, GFP transgenik parazitler sayesinde mümkün olmuştur. Drexel Üniversitesi'nden James Burnes tarafından bağışlanmıştır.

Floresan işaretli parazitlerin hareketlerinin görüntülenmesi, letal ve non-letal suşlar arasındaki davranış farklılıklarını belirlememizi sağlayacaktır. Canlı mikroskopi deneyleri, sıcaklık kontrollü bir inkübasyon sistemi ve 63 x gliserol objektifi ile donatılmış bir Leica çok fotonlu mikroskpta gerçekleştirilmiştir. Hayvanı, dalak kısmı objektife bakacak şekilde bir lam örtüsüyle birlikte mikroskop tablasına yerleştirin. Başlangıçta.

Dalağın düşük büyütmelerde görüntülenmesi, organın mikrodolaşım yapısına genel bir bakış sağlayacaktır. Otofloresan dokuyu kullanarak dalağa odaklanıldığında, GFP parazitlerinin dalağın farklı bölgelerinden geçtiği gözlemlenir. Merhaba, ben Barselona Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Merkezleri'nden Maria Albo; bu çalışmada dalağın intravital görüntülemesini gerçekleştireceğiz.

Enfekte kırmızı kan hücrelerinin kan akışını ve hareketliliğini incelemek için, organ hareketini önlemek adına oldukça yararlı olan yüksek hızlı görüntülemeye imkan tanıyan rezonans tarayıcıyla donatılmış bir konfokal mikroskop kullanacağız. Bu, görüntüleme aralığının seçilmesine olanak tanıyan spektral bir mikroskoptur. Çok hızlı görüntüleme yapabilmek için, iki floresein işaretlemesi ve yansımayı eş zamanlı olarak elde edeceğiz.

Dalak mikrovaskülatürünü belgelemek için RBC, refleksiyona, kontrasta ve Vidal boyalarına yardımcıyla görüntülemek üzere farklı bölgeler seçin. Şimdi, kırmızı pulpanın üç boyutlu ağ yapısındaki parazit hareketini takip etmek için Vidal mikroskopisi ve Image J yazılımı kullanarak, damar kan akışındaki parazit hareketliliğinin nasıl ölçüleceğini açıklayacağız. Yüksek hızlı tarama modunu kullanarak beş Z derinliğinde görüntüler elde edin.

Tek bir floresan hücrenin takibini kolaylaştırmak için görüntü yığınlarını Z kodlu renkli videolara dönüştürün. Ayrıntılı bilgiler metinde verilmiştir; her videoda X, Y, Z ve T koordinatlarını kullanarak derinlikte zaman içinde farklı partiküller takip edilebilir. Yönelim, ortalama hız ve kalış süresi gibi mobilite parametreleri hesaplanabilir ve suş popülasyonları arasında karşılaştırmalı analiz yapılmasına olanak sağlamak için dağılım haritaları şeklinde temsil edilebilir. Dalaktaki vasküler akış, destekleyici tabloda belirtilen dekstrin gibi çeşitli floresan moleküllerin sistemik enjeksiyonu ile görüntülenebilir.

Endojen eritrosit yansıma kontrastı kullanarak, damarları lazer tarama yönüyle yatay olarak konumlandırıp geliştirilmiş Hat ortalaması (Line average) ayarını kullanarak merkez hat kan akışını tarayın. Bu görüntülerde, hareketli hücrelerden kaynaklanan çizgiler kan akışını hesaplamak için kullanılacaktır; dalgalanmaları telafi etmek amacıyla farklı çaplardaki damarların ve kardiyak döngü boyunca görüntülerini alın. Dalak, sıtma araştırmalarında uzun süredir bir kara kutu olarak kabul edilmektedir ve burada, bu organdaki parazit enfeksiyonu ve kan akışı dinamikleri hakkında içgörü kazanmak için nicel bir intravital mikroskopi yaklaşımı geliştirdik; bu yaklaşım, enfekte kırmızı kan hücrelerinin dalağa in vivo yapışması gibi önemli biyolojik soruları ele almamıza olanak tanımaktadır.

Teşekkür ederiz ve.