İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray'ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, insan protein atlası gibi yüksek kapasiteli bir projede, protein ekspresyonuna yönelik olarak birden fazla dokudan eş zamanlı bilgi edinmek için verimli bir yöntem kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle formaldehit ile tespit edilmiş ve parafine gömülmüş dokuların temsilci alanlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, işaretli alanlarle punch yöntemiyle örneklenir ve seçilen çekirdekler tek bir parafin bloğunda, yani bir doku mikro-dizisinde toplanır.

Ardından TMA'dan kesitler alınır ve immünohistokimya uygulanır. Son olarak, protein ekspresyon paterni analiz edilir ve veriler insan protein atlasında yayınlanır. Nihayetinde, doku mikro dizileri ve immünohistokimya aracılığıyla doku ve hücrelerdeki protein ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, tekil doku paren bloklarından immünohistokimya yapılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, değerli biyolojik materyallerin korunabilmesi ve deneylerin daha tekrarlanabilir olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer avantajı ise hem ENT maliyetlerinden hem de laboratuvar işlem süresinden tasarruf sağlayabilmenizdir. Bu prosedürü, doku çekirdeklerinin standart bir uzunlukta elde edilmesi aşamalarını göstermek üzere laboratuvarımdan laboratuvar teknisyeni Ian call Bay sunacaktır.

Stiletin işaretlemesini yapın. Uygun zımbaları yerleştirmek için parafinin çatlamasını önlemek amacıyla, parafin bloğunun her iki yanında 2,5 ila 3,0 milimetrelik paylar bırakılması önerilir. Zımbanın yerini sabitleyen altıgen soket vidalarını gevşetin ve zımba göbeğindeki kanalın plastik V bloğu içindeki metal çubuğa sıkıca yerleşmesini sağlayacak şekilde zımbayı konumlandırın.

Metal klipsin kenarının yatay olduğundan emin olarak vidaları sıkın. Sol tarafa alıcı punch'ı, sağ tarafa ise donör punch'ı yerleştirin. Punch'ları X ve Y eksenleri boyunca hareket ettirmek için XY ayar düğmelerini ve bunların dijital mikrometre okumalarını kullanın.

Makineyi sıfırlamak için sıfır BS düğmesine basın; inç ve milimetre arasında geçiş yapmak için inç milimetre düğmesine basın. Dokuz çarp sekizlik bir şablon için bir milimetrelik bir punch kullanırken, alıcı punch'ın çok fazla aşağı itilip zarar görmesini önlemek için delikler arasındaki mesafe, delik merkezleri arasında ölçüldüğünde iki milimetre olmalıdır; punch'ı itmek için maksimum derinliği, tutucuya boş bir kaset yerleştirerek ve Z kılavuzunun sol üst köşesindeki derinlik durdurma vidasını kullanarak ayarlayın, alıcı punch'ın alt konumunu kasetin tabanının bir milimetre üzerine ayarlayın. Bir doku kesiti üzerinde ilgili alanı seçip işaretledikten ve doku mikroarray üretimi için bir şablon tasarladıktan sonra, alıcı bloğu tutucuya yerleştirin ve vidaları sıkmak için en küçük tornavidayı kullanın.

Parafinin kasetten kopmasını önlemek için vidaları aşırı sıkmaktan kaçının. Alıcı punch'ı alıcı bloğun içine yaklaşık beş milimetre aşağıya doğru itin ve punch üzerindeki tutamağı kullanarak punch'ı ileri geri döndürün. Ardından, yayların punch'ı yukarı taşıyabilmesi için aşağıya doğru uygulanan itme basıncını yavaşça gevşetin.

Stili kullanarak pançı boşaltın ve parafin çekirdeği atın. Ardından, donör pança geçmek için taretin konumunu değiştirin. Sonrasında, donör blok köprüsünü, donör blok alıcı blok tutucunun üzerinde olacak şekilde yerleştirin.

Örnekleme yapılacak dokuyu belirlemek için, ilgili bölgenin işaretlendiği karşılık gelen bir hematoksilin ve eozin boyama lamı kullanın. Donör bloğu sol elinizle sabit tutun ve punch'ı sağ elinizle itin. Stilete baskı uygulamayın. Derinlik durağı, donör blok için punch hareketini uygun konumda engellemez; bu nedenle, stiletteki ikinci işaret göründüğünde itmeyi durdurmanız önemlidir.

Zımba kolunu bir kez yavaşça döndürün. Donör bloğu donör blok köprüsü üzerinde tutmaya devam ederken aşağı doğru uyguladığınız baskıyı bırakın. Köprüyü ve donör bloğu çıkarın.

Donör zımbanın daha önce açılan delikle hizalandığından emin olun. Zımba konumunu set vidalarını kullanarak ayarlayın. Donör zımba ve alıcı bloktaki delik hizalı değilse, zımbanın ucu alıcı bloktaki deliğin üst kısmına ulaşana kadar zımbayı dikkatlice aşağı doğru itin.

Bu pozisyonu korurken, doku örneğini deliğe boşaltmak için stiletle işlem yapın. Örnek yüzeyi, blok yüzeyi ile aynı hizada olmalıdır. Taretle tekrar alıcı punch'a geri dönün.

XY ayar düğmeleriyle bir sonraki konuma geçin ve dizi tamamlanana kadar alıcı bloktan örnekleme işlemini tekrarlayın. Alıcı bloğu çıkarmak için tutucudaki vidaları gevşetin. Bloğu, uygun bir rafa yerleştirilmiş cam bir lam üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde koyun ve bloğu 42 °C'de 40 dakika boyunca pişirin.

Slaytı ve bloğu fırından çıkarın ve cam slaytı nazikçe sürterek bloğun yüzeyini düzleştirin. Cam slaytlı bloğu 10 dakika boyunca bir soğutma plakasına yerleştirin. Cam slaytı bloktan çıkarın.

Blok şu an tamamlanmış olup kesite hazırdır. Kesim işleminin ardından, doku mikro-dizisi ilgi duyulan bir proteine özgü antikor ile boyanır ve dijitalize edilir. www.proteinatlas.org adresindeki web sitesine giderek proteini insan protein atlasında aratınız.

İlgilenilen proteinin ensemble kimliğini, uni prote erişim numarasını veya örneğin insülin gibi HGNC adını girin. İlgilenilen proteinin üzerine tıklayın ve normal doku ve organ özetine kadar aşağı kaydırın. Genel bakış, pankreastaki protein ekspresyonunu göstermektedir.

Sekmeye tıklayın. Daha fazla doku verisi. Organa göre sıralanmış normal doku görünümü ekrana gelecektir.

Aynı proteine yönelik üç farklı antikor için İHK sonuçlarını görüntülemek üzere pankreasa tıklayın. Pankreasın yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü görmek için bir görüntüye tıklayın. Bu şekilde, doku mikro dizilerinden kalite örnekleri gösterilmektedir; satırlar, sütunlar ve parafin kenarı arasında yeterli boşluk olan, düz ve düzgün hizalanmış bir dizi görülmektedir. Burada, bazı çekirdekler kenara çok yakındır ve bu durum muhtemelen kesit alma sırasında sorunlara yol açmıştır.

Bu doku mikro dizisi çok uzun süre fırınlanmış ve uygun şablon kullanılmadığı için çökmüştür. Burada, düz ve hizalı kolonlara sahip, düzgün kesilmiş bir kesit hematoksilin ve eozin ile boyanmıştır. Kötü veya kirli bir bıçak, burada gösterilen yırtılmalara veya bunun gibi sıkışmış kesitlere neden olabilir.

Lenf düğümlerindeki germinal merkez hücreleri, burada görüldüğü gibi arka plan boyanması olmaksızın spesifik bir sitoplazmik boyanma ile sonuçlanan, optimal şekilde titre edilmiş bir antikor sergilemektedir. Primer antikor konsantrasyonu çok düşük olduğunda veya hedef protein immün boyanan dokularda mevcut değilse negatif veya zayıf boyanma görülür. Bu doku kesiti, primer antikor konsantrasyonunun çok yüksek olması nedeniyle aşırı boyanmıştır.

Koyu renk; taşma, çapraz reaktivite ve yalancı pozitiflik nedeniyle sübhücresel konumun belirlenmesinde zorluklara yol açar. Bu videoyu izledikten sonra, bir doku belirteç dizisi (tissue marker array) oluşturma ve bunu immünohistokimya uygulayarak protein ekspresyonunu analiz ederken nasıl kullanacağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, insan dokularındaki ve hücrelerindeki protein ekspresyonu için Human Protein Atlas'ta nasıl tarama yapacağınızı iyi kavramış olmalısınız.