Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, flu çip (düşük yoğunluklu mikroarray platformu) üzerinde influenza viral alt tiplerini tespit etmek ve karakterize etmek için yeni ve hızlı bir sinyal amplifikasyon yönteminden yararlanmaktır. Bu işlem, biyotinlenmiş DTP'lerin dahil edilmesiyle ve influenza RNA ekstraktlarından matris gen segmentini ve yapısal olmayan bir gen segmentini amplifiye etmek için beş prime fosforil uçlu primerlerin kullanılmasıyla gerçekleştirilir. PCR'ı, kısa tek zincirli, biyotinlenmiş ve amplifiye edilmiş viral ürünler oluşturmak için enzimatik sindirim ve fragmantasyon takip eder; bu ürünler daha sonra hibritizasyon işleminden sonra array ile hibritlenir.

Fox tespiti, hibridizasyonun gerçekleştiği büyük polimer lekeleri büyütmek için fotopolimerizasyon kullanır ve influenza viral alt tiplerini tespit etmek için diferansiyel hibridizasyon modellerinden yararlanılır. Bu tekniğin standart floresan tespit gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça düşük maliyetli olması ve floresanla benzer analitik hassasiyette, çıplak gözle görülebilen hızlı bir sonuç sağlamasıdır. Bu yöntem, evrensel bir tespit yöntemi olduğu için flu çipi kullanarak influenza virüslerinin karakterizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

Ampl Fox, diğer DNA ve protein tabanlı düşük yoğunluklu mikro diziler gibi çok çeşitli diğer sistemlere de uygulanabilir. Teorik olarak, biyotinize edilmiş herhangi bir ürün amox kullanılarak tespit edilebilmelidir. Prosedürü, son birkaç yıldır Fox cihazının ve tespit kimyasının geliştirilmesinde merkezi rol oynayan Endeavor'dan yardımcı bilim insanı Amber Taylor ve araştırma asistanı Kevin Moulton tanıtacaktır.

Bir viral RNA ekstraksiyon kiti ve üreticinin protokolünü kullanarak 200 µL viral izolatdan viral RNA ekstrakte edin. 60 µL nihai hacimde elüsyon yapın ve ekstraktları daha sonra kullanmak üzere -70 °C veya daha düşük sıcaklıkta saklayın. Ardından, üreticinin protokolüne uygun olarak buz üzerinde R-T-P-C-R master mix hazırlayın.

BİYOTİNLENMİŞ DNTP karışımı kullanarak, gösterilen konsantrasyonları içeren flu çip primer karışımını master mix'e ekleyin. Her setten bir primer, enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için beş prime fosfo grup içermelidir. flu A primer seti 1032 baz çiftlik bir ürün, flu B primer seti ise 811 baz çiftlik bir ürün üretir.

Master mix'i kısaca vorteksleyerek ince duvarlı PCR tüplerine 18 µL şeklinde dağıtın. Ardından her bir reaksiyon tüpüne iki µL RNA kalıbı ekleyin. PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve uygun bir bağlanma sıcaklığı içeren bir döngü profili kullanın.

Bu analizde kullanılan döngü profili burada gösterilmiştir. PCR reaksiyonu başına 2,2 µL enzim reaksiyon tamponu, 0,8 µL nükleaz içermeyen su ve 1,0 µL lambda eksonükleaz enzimini birleştirerek enzimatik sindirim karışımını hazırlayın. Örnekleri termal döngüleyiciden çıkarın ve her bir PCR tüpüne dört µL ekleyin.

Numuneleri termal döngüleyiciye geri yerleştirin ve termal döngüleyiciyi önce 15 dakika boyunca 37 °C, ardından 10 dakika boyunca 95 °C olacak şekilde programlayın. Sonrasında, hibridize edilecek mikro dizilerin etrafına tek kullanımlık hibridizasyon kuyucukları yerleştirin. Ardından lamları, bir orbital çalkalayıcı üzerinde 110 mL saflaştırılmış su içinde beş dakika boyunca yıkayın.

Lamların kuyucuk kenarına nazikçe bir doku mendili değdirerek lamları kurulayın. Kısa bir süre karıştırılmış olan fragmanlanmış tek zincirli DNA ürünlerinin her birini 22 µL iki x hibridizasyon tamponu ile birleştirin ve mikroarray kuyucuklarına 40 µL pipetleyin. Lamların bir nem odasında bir saat boyunca hibridize olmasını sağlayın; hibridizasyon sonrası lamları nem odasından çıkarın ve her bir lamı 2 mL yıkama tamponu D ile kısaca durulayın. Lamları bir lam rafına yerleştirin.

Ardından, orbital çalkalayıcı kullanarak ayrı kaplara 110 mililitre A ve B yıkama tamponları ekleyin. Lam rafını, sonraki tüm yıkamalar için kullanılacak olan 60 ila 90 RPM hızındaki orbital çalkalayıcıda, A tamponu ile bir dakika boyunca yıkayın. Daha sonra lam rafını A yıkama tamponundan çıkarın ve kısaca D yıkama tamponu ile durulayın. Lam rafını B yıkama tamponuna aktarın ve orbital çalkalayıcıda beş dakika boyunca yıkayın.

Yıkama işleminden sonra, her slayttaki dizileri bir doku mendili ile nazikçe kurulayın ve kurulanmış slaytları nem odasına yerleştirin. FOX kolorimetrik tespit basamaklarına hazırlık için, işlenecek her dizi için 10 µL amplitüd, 20 µL 2x amplitüd tamponu ve 10 µL saflaştırılmış suyu birleştirin; her diziye 40 µL etiketleme karışımı aktarın ve etiketleme reaksiyonunun kapalı bir nem odasında beş dakika boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Hibritleme sırasında, bir kap içerisinde 110 mL yıkama tamponu C hazırlayın. Etiketlemeden hemen sonra, her diziyi yıkama tamponu D ile durulayın. Her slaytı slayt rafına yerleştirin ve orbital çalkalayıcıda yıkama tamponu C ile beş dakika boyunca yıkayın; tampon C yıkamasından sonra, slayt rafını saflaştırılmış su içeren bir kaba üç kez kısa süreliğine daldırın.

Tuz kalıntılarını gidermek için dizileri daha önce gösterildiği gibi kurutun. Dizileri, 24 saat içinde tamamlanması gereken foto aktivasyon ve görüntüleme işlemine kadar karanlık bir lam kutusunda saklayın. Ardından, Amli Fox okuyucuyu açın ve dizi örnek algılamasından önce Amli view yazılımının foto aktivasyon için hazır olduğundan emin olun.

Öncelikle, kısa bir kalibrasyon prosedürünü takip ederek tüm numuneler için optimal foto aktivasyon süresini belirleyin. Günlük her kullanımda bir kez, Amplify çözeltisini oda sıcaklığına getirin ve karıştırmak için kısa süreliğine vorteksleyin; ardından Amplify vialinin içerisine üç µL amplify enhancer pipetleyin ve iyice vorteksleyin. Kabarcık oluşmadığından emin olarak, Amplify çözeltisinden 40 µL'yi her seferinde yalnızca bir lama 10 saniye boyunca eşit şekilde uygulayın.

Mikrodizilim lamını Amplify Reader'ın foto aktivasyon bölmesine yerleştirin. Kalibrasyon sürecinde belirlenen foto aktivasyon süresini kullanarak, PL görünüm yazılımından "başlat" seçeneğini belirleyerek foto aktivasyonu başlatın. İşlem tamamlandığında, fazla amplify clear polimerini uzaklaştırmak için mikrodizilimi iki mililitre saflaştırılmış su ile durulayın; hedef DNA içeren spotlarda polimer oluşumu gerçekleşmiş olup artık daha iyi görselleştirilebilir.

Boyama işleminden sonra, polimer lekelerinin iki dakika boyunca kurumasına izin verin. Ardından, array üzerine iki damla amply red damlatın ve boyamanın iki dakika boyunca devam etmesini sağlayın. Boyama sonrası lamı hızla saflaştırılmış su ile durulayın ve daha önce gösterildiği gibi kurutun; sonuçları işlemek için amli yazılımını kullanarak görüntü toplamak amacıyla lamı Amli Fox okuyucunun görüntüleme bölmesine yerleştirin. Soldaki görüntü, 2009 yeni H1N1 örneğinin Amli Fox tarafından tespitini göstermektedir.

Sağdaki görüntü konfokal floresan mikroarray tarayıcı tarafından üretilen geleneksel floresan kullanırken, her iki yöntem için de aynı genel tespit paterni kolayca görülebilmektedir. Ancak, Amli fox sonucu çıplak gözle görülebilir durumdadır. Bu görüntüler; insan kaynaklı, H3N2 insan kaynaklı, H1N1 domuz kaynaklı ve tespit edilebilir influenza içermeyen negatif bir fox array'den gelen flu çip sonuçlarını göstermektedir.

Mavi ile çerçevelenmiş iki ve üç numaralı diziler, gösterilen tüm influenza alt tipleri için sinyal üretmektedir, ancak sağ altta kırmızı ile çerçevelenmiş diziler sadece domuz kaynaklı H1N1 örneği için sinyal üretmektedir. Negatif örnek, yeşil ile çerçevelenmiş bir iç kontrol dizisinde sinyal göstermekte olup bu durum, RT-PCR reaksiyonunda herhangi bir inhibisyon veya başarısızlık olmadığını belirtmektedir.

Tüm süreçte yetkinlik kazanıldığında, tüpten ekstraksiyondan amox tespitine ve nihai sonuç yorumlamasına kadar olan işlemler yaklaşık altı saatte gerçekleştirilebilir. Cihaz kalibrasyonu da dahil olmak üzere prosedürün Ampl Fox tespit kısmı, bu prosedür takip edildiğinde yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir. Ek soruları yanıtlamak amacıyla kısmi veya tam genom dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu influenza testi, özellikle benzersiz bir hibridizasyon paterniyle sonuçlanan örnekler için bir ön tarama olarak tasarlanmıştır. Saptama genel bir analiz olduğu için, araştırmacıların saptamanın değer katabileceği yeni ve ilgi çekici düşük yoğunluklu mikroarray uygulamaları bulacaklarını umuyoruz.