Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Bu video, tally görüntü tabanlı sitometre kullanılarak GFP eksprese eden hücrelerde hücre canlılığının belirlenmesi prosedürünü göstermektedir. GFP transdüksiyonu yapılmış hücreler, tüm ölü hücreleri propidyum iyodür ile kırmızıya boyayan tally viability kit dead cell red kullanılarak boyanır; hücreler bir tally hücresel analiz lamına pipetle aktarılır ve parlak alan ile kırmızı ve yeşil floresan görüntüleri elde eden ve analiz eden sitometreye yüklenir. Ardından, geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında hücre sayısı, hücre boyutu, PI floresan yoğunluğu ve GFP floresan yoğunluğunu görüntülemek için histogramlar oluşturulur.

Tali, hücre canlılığı ve ekspresyonuna ilişkin benzer veriler sağlayabilir. Ancak, bu görüntü tabanlı sitometri, incelenen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgiler sunar. Bu tekniğin akış sitometrisi veya floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tally görüntü tabanlı sitometrenin hücre örneğiniz hakkında hem kantitatif hem de görsel bilgiyi eş zamanlı olarak sağlamasıdır.

Ayrıca, sayım cihazı, hem bir akış sitometresinden hem de bir floresan mikroskobundan daha kolay kullanılır, daha ucuzdur ve daha küçük bir yer kaplar. Bu, araştırmacıların GFP eksprese eden hücrelerdeki canlılık gibi kantitatif analizleri laboratuvar tezgahında hızlı bir şekilde gerçekleştirmelerine olanak tanır. Bu prosedürde, 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonundaki U2 OS hücreleri, ölü hücreleri propidyum iyodür ile boyamak için nükleer hedefli hücre ışığı GFP viral konstrüktü ile transduksiyonu yapılmış olup, hücre süspansiyonundan 100 µL yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır.

Analiz için mililitre başına 1 × 10⁵ ile 1 × 10⁷ hücre arasında bir konsantrasyon önerilse de konsantrasyonun tam olarak bu değerlerde olması gerekmez. Ardından, bir mikrolitre tally dead cell red reaktifi ekleyin. Daha sonra karıştırmak için kısa süreli vorteksleyin, boyama reaktifi ve hücre karışımını oda sıcaklığında, karanlıkta bir ila beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, vakit kaybetmeden tally görüntü tabanlı sitometre ile analize geçin. Tally, özellikle bu cihaz için tasarlanmış tek kullanımlık plastik hücresel analiz lamları kullanır. Lamı yüklerken her zaman kenarlarından tuttuğunuzdan emin olun.

Örnekten 25 µL'yi yarım ay şeklindeki örnek yükleme alanlarından birine yavaşça pipetleyin. Burada, boyanmamış transdüksiyon yapılmamış kontrol hücreleri A bölmesine ve boyanmış GFP eksprese eden hücreler B bölmesine yüklenir. GFP eksprese eden hücrelerde bir canlılık analizi gerçekleştirmek için sitometrenin ana ekranındaki G-F-P-R-F-P seçeneğine dokunun. Ardından sağ tarafta analiz seçenekleri görünecektir; GFP artı canlılık seçeneğini seçin.

Cihaz daha sonra, örnek serisine isim verilip verilmeyeceğini soracaktır. "Şimdi isimlendir" (name now) seçeneğine basın. Ardından dokunmatik ekranı kullanarak örnek serisinin adını yazın ve "kaydet" (save) seçeneğine basın; tally sitometre otomatik olarak ölçüm ekranına geçecektir.

Ardından, arka plan floresansını ölçmek için, burada görüldüğü gibi ölçüm ekranının sağ alt yarısındaki arka plan sekmesine basın. Varsayılan ayar, dokuz hücre alanının görüntüleneceğini belirtir. Şimdi, kontrol örneği cihaza bakmayacak şekilde, lamı yükleme portuna durana kadar yerleştirin.

Yeni boyanmamış hücre kontrolünü yerleştirmek için arka plan ekranındaki dokunmatik basma noktasına kuvvet uygulamayın. Lam otomatik olarak cihazın içine çekilecek ve hücrelerin canlı görüntüsü ekranda görüntülenecektir. Odaklama yaparken, odak düğmesini kullanarak hücreleri uygun görüş düzlemine getirin.

Kırmızı yakınlaştırma düğmesini 4x veya 16x konumuna kaydırın. Hücre popülasyonunu daha iyi görebilmek için, hücrelerin her birinin etrafında parlak bir hale ile birlikte tek biçimle koyu renkli görünmesi gerekir. Burada gösterildiği gibi, arka plan ile hücrelerin kenarları arasındaki geçiş bulanık olduğunda ve hücre sınırları belirgin olarak tanımlanamadığında, hücreler eksik sayılabilir.

Hücrelerin merkezleri parlak ve çevreleri koyu olduğunda, sayıları olduğundan fazla çıkabilir. Hücreler odaklandıktan sonra, boyanmamış hücre kontrolünü çalıştırmak için dokunmatik ekrana basın. Arka plan floresansını ölçmek için sitometre otomatik olarak görüntüler yakalayacak ve her bir görüş alanının küçük resimlerini görüntüleyecektir.

İlerleme çubuğu, analize ilişkin sürekli bir güncelleme sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometre lamı otomatik olarak dışarı çıkarır ve yakalanan görüntülerin analizinden elde edilen verileri sunar. Kaydedilen veriler, arka plan sekmesinin açılır menüsünde görüntülenir.

Arka plan kontrol örneğine, deneye verilen ismin aynısı atanacaktır. PI ile boyanmış GFP transduksiyonlu örneği çalıştırmak için lamı cihazdan çıkarın, ters çevirin ve transduksiyonlu örnek cihaza bakmayacak şekilde yeniden yerleştirin. Örnek sekmesine basın ve ardından yeni örneği yerleştirmek için "press" seçeneğine dokunun.

Görüntü ekranda belirdiğinde, hücreleri odaklamak için odaklama düğmesini kullanın. Daha önce olduğu gibi, ardından örneği çalıştırmak için dokunmatik basma düğmesine basın. Görüntü yakalama tamamlandıktan sonra, analizden elde edilen veriler örnek sekmesi altında görünür ve sitometre lamı otomatik olarak uygun şekilde dışarı atar.

Hücre sayım analiz lamını imha edin. Biyotehlikeli atık oldukları için bu lamlar yeniden kullanılamaz. Örnek çalıştırıldıktan sonra, örneğe eşik değerleri uygulanabilir.

Burada belirli hücre popülasyonlarını analiz etmek için, canlı ve ölü hücrelerin yüzdesini belirlemek amacıyla eşik değerlerini ayarlayacağız. Örnek sekmesi altında GFP eksprese eden hücrelerde; GFP eksprese eden canlı hücrelerin sayısı ve yüzdesi, GFP eksprese eden ölü hücrelerin sayısı ve yüzdesi ve toplam canlılık oranı yer alır. Ortalama hücre boyutu, sayılan hücre sayısı ve hücre konsantrasyonu görüntülenir.

Ek olarak, ekranın alt kısmında hücre boyutunu, yeşil floresans ve kırmızı floresansı gösteren histogram grafikleri yer almaktadır. Hücre boyutu geçidini (gate) ayarlamak ve kalıntıları dışlamak için hücre boyutu küçük resmine dokunarak hücre boyutu histogramını açın. Hem büyük hem de küçük olayları dışlamak için mavi sürgü çubuklarını hareket ettirin.

Kapılar içindeki hücreleri dahil etmek için "apply" (uygula) seçeneğine dokunun. Analize GFP floresansını eklemek için GFP histogram önizlemesine dokunarak onu açın.

Eşiği en sönük pikinin hemen sağına ayarlamak için mavi sürgü çubuğunu hareket ettirin. Kontrol örneğini kılavuz olarak kullanın. Bu işlem, analizin GFP pozitif hücreleri dahil etmesini, ancak otofloresan hücreleri hariç tutmasını sağlar.

Hücre içindeki biyolojik moleküllerle karşılaşıldığında sıklıkla otofloresans gözlemlenir; onaylamak ve önceki ekrana dönmek için dokunun. Örnek sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanal için ayarlanan kapı ve eşikleri yansıtmalıdır. Ardından, PI boyalı hücreleri otofloresanstan veya örnekte bulunan herhangi bir arka plandan ayırmak için PI histogram küçük resmine basarak onu tekrar açın.

Kontrol örnek piki, histogramda gri bir pik olarak görüntülenecektir. Kırmızı pik, örnek floresansını temsil eder. Arka plan floresansı, bu cihazda sıfır RFU değerine en yakın pik olarak görüntülenir.

PI kanalındaki arka plan floresansını gidermek için eşik değerini ayarlamak üzere mavi sürgü çubuğunu hareket ettirin. Bu piki hariç tutmak için, kontrol örneğindeki gri piki referans olarak kullanın. PI kanalındaki eşik değeri uygun şekilde ayarlandığında, onaylamak ve önceki ekrana dönmek için uygula düğmesine dokunun; sayım cihazı verileri otomatik olarak yeniden analiz edecek ve örnek sekmesindeki sonuçları güncelleyecektir.

Ardından, her hücrenin doğru şekilde atandığını görsel olarak doğrulamak için yakınlaştırma sekmesine basın, ardından incelemek için yakalanmış bir görüş alanını görüntü küçük resmine basarak seçin. Sonra katmanlar sekmesine basın. Ardından, o kanal aracılığıyla yakalanan görüntüyü görüntülemek için GFP veya PI düğmesine basın.

Katmanı ekrandan kaldırmak için aynı düğmeye tekrar basın veya katmanları üst üste bindirmek için her bir kanala karşılık gelen düğmelere dokunarak hücrelerin belirli bir kanal üzerinden nasıl sayıldığını belirleyin. Yalnızca parlak alan kanalı üzerinden sayılan ve floresan eksprese etmeyen hücrelerin etrafındaki dairelere dokunulduğunda bunlar mavi renkle çevrelenecektir. Bu, belirli bir hücrenin yeşil kanalda ekspresyon gösteren canlı hücreler olduğunu belirtir.

Kırmızı kanalda eksprese olan GFP'li hücreler yeşil daire içine alınacaktır. PI ile boyananlar kırmızı daire içine alınacak olup bunlar her ikisinde de sayılan ölü hücrelerdir. Hem kırmızı hem de yeşil kanaldakiler sarı daire içine alınacaktır.

Bu durum, hücrenin GFP eksprese ettiğini ancak aynı zamanda pi ile boyandığını ve dolayısıyla ölü olduğunu gösterir. Ekran üzerinde ara sıra siyah daireler görünebilir. Bunlar, tanımlanmış olan ancak hücre boyutuna bağlı olarak analiz dışında tutulmuş nesnelerdir.

Floresans ifade eden her hücre uygun renkle daire içine alınana kadar, az önce açıklanan adımları kullanarak floresans histogramındaki eşiği hassas bir şekilde ayarlamaya devam edin. Tüm analiz parametreleri cihazın veri sekmesi altına otomatik olarak kaydedilir.

Sayımlama sistemi 500 örnek çalışmadan gelen veri dosyalarını saklayabilir. Veri sekmesinde saklanan her dosya yeniden analiz için uygundur. Dosya veri sekmesinden seçildiğinde, dosya yeniden açılır ve verileri arşivlemek ve raporlar oluşturmak için tüm histogramlar ve katmanlar aktif hale gelir.

Cihazda depolanan veriler, bir USB sürücü kullanılarak bilgisayara aktarılabilir. Dört temsilci hücre tipi, nükleer hedeflenmiş hücre ışığı GFP viral konstrüktü ile transdüse edilmiş, dead cell red reaktifi içeren tally viability kiti ile boyanmış ve burada gösterildiği gibi bir akış sitometresinde tally ile analiz edilmiştir. Her iki yöntem de her bir hücre tipi için GFP eksprese eden popülasyonun yaklaşık olarak aynı yüzdesini ve toplam popülasyonun hem canlı olup hem de GFP eksprese eden kısmının yüzdesini raporlamıştır.

Bu veriler, Tali sitometresinin bir popülasyondaki toplam GFP ekspresyonu ile canlı popülasyondaki GFP ekspresyonunu ayırt edebildiğini kanıtlamaktadır. Hücre örneğinizdeki floresan ekspresyonunu ve canlılığı değerlendirmek için Tali görüntü tabanlı sitometrenin nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu teknoloji, bireysel hücre çalışmaları ile popülasyon bazlı hücre çalışmaları arasındaki boşluğu doldurmaktadır.

Tally görüntü tabanlı sitometre kullanarak, bireysel hücrelerin yanı sıra daha geniş hücre popülasyonları hakkında kantitatif ve kalitatif görsel bilgiler toplayabilirsiniz. Aynı prosedür kullanılarak; apoptoz, RFP ekspresyonu ve hücre canlılığı dahil olmak üzere birçok farklı analiz gerçekleştirilebilir. Ekspresyon göstermeyen hücreler için potansiyel uygulamalar, gen ekspresyonu değerlendirmesinden ilaç etkinliği çalışmalarına kadar geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır.