Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu deney, çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında renal proksimal tübül hücrelerindeki mitokondriyal ve hücresel işlevlerini belirlemek için protein kinaz C ISO xms'nin seçici modülasyonunu kullanır. İlk olarak, renal korteksten primer renal proksimal tübül hücrelerini veya renal proksimal tübüllerinkine benzeyen oksidatif metabolizmaya sahip RPC'leri izole edin.

RPC'leri, protein kinaz C'nin aktif ve inaktif formlarını eksprese eden adenoviral vektörlerle in vivo olarak enfekte edin. Daha sonra, izoenzimin ATP sentezleme ve hücre ölümünü önleme konusundaki mitokondriyal yeteneği üzerindeki etkisini belirlemek için farklı mitokondriyal fonksiyonları ve hücre canlılığını analiz edin. Ayrıca, birlikte alınan hücresel lizatlarda fosforillenmiş ve protein kinaz C epsilon için immünoblots analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar, protein kinaz epsilon aktivasyonunun mitokondrinin ATP üretme yeteneğini negatif yönde düzenlediğini, hücresel ATP seviyelerini ve renal proksimal tübül hücrelerinin canlılığını azalttığını göstermektedir. Hücre hatları gibi mevcut tekniklerimize kıyasla bu tekniğin temel avantajı, renal proksimal tübül hücrelerinin primer kültürlerinin, renal proksimal bölgelerin diferansiye fonksiyonlarını ve oksidasyon mekanizmalarını korumasıdır. Protein kinazlar hedef ve potansiyel terapötik ajanlar olarak kullanılabildiğinden, bu tekniğin etkileri tedaviye, böbrek hasarının önlenmesine veya hasar sonrası böbrek iyileşmesinin hızlandırılmasına kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, hasar ve iyileşme mekanizmasına ışık tutabilir. Ayrıca, her bir böbreğin korteksini toplamak için sırasıyla 50 mililitre steril D-M-E-M-F 12 besiyeri, steril fosfat tamponlu salin, pH 7.4 ve PBS demir oksit çözeltisi ile taze izole edilmiş tavşan böbreği gibi örneklere uygulanabilir.

Önce dokuyu 15 milliliter'lık alt homojenizatör kullanarak homojenize edin. Ardından homojenatı, iki steril ağ süzgeçten geçirerek bir litrelik steril bir behere aktarın. Süzgeçlerde kalan hücreleri deferoksamin içeren tampon ile durulayın.

Altta kalan tüm dokuyu, konik santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 40 mililitre deferoksamin içeren tampona, 85 mikronluk elek aracılığıyla aktarın. Hücre süspansiyonunu güçlü mıknatıs ile nazikçe karıştırın.

Demir yüklü glomerülleri yakalayın ve mıknatısa yapışmış demiri aspire edin. Hücre süspansiyonunun hacmini 40 mililitreye ayarlayın ve kollajenaz içeren bir mililitre sindirim ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 17 dakika boyunca inkübe edin.

Süspansiyonu nazikçe karıştırın. Birkaç yıkamanın ardından, hücreleri 4 °C'de, 2 dakika boyunca 50 ×g'de santrifüj ederek hasat edin. Hücre peletini, glikoz içermeyen 46 mL besiyerinde yeniden süspande edin.

Primer RPE hücreleri, orbital bir çalkalayıcıda, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında, iki mililitre glukozsuz D-M-E-M-F 12 besiyeri içerisinde kap başına bir miligram protein yoğunluğunda kültüre edilir. Besiyeri tazelendikten sonra, konfluen RPT hücreleri, ya konstitütif aktif protein kinaz C epsilon ya da dominant negatif protein kinaz C epsilon için CD NA taşıyan adenovirüs ile enfekte edilir; 24 saat inkübe edilir, besiyeri tazelenir ve transfekte edilmiş primer RPC'ler 24 saat daha kültüre edilir. Primer hücre monolayer'inin mitokondriyal morfolojisini görselleştirmek için besiyeri tazelenir, MIT tracker red 580 eklenir ve kaplar 30 dakika boyunca inkübatöre geri konulur.

Ardından, canlı tek tabakaları su daldırma objektifi kullanarak floresan mikroskobunda inceleyin. İkinci adım. Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, RPTC süspansiyonunun durum 3 solunumunu Clark tipi elektrot ile donatılmış bir oksijen tüketim odasında analiz edin.

Öncelikle, DP yokluğunda durum iki solunumunu ölçün. Ardından, nihai konsantrasyonu 0.4 millimolar olacak şekilde bir DP ekleyin. Durum üç solunumunu başlatın; ardından durum dört solunumu için mililitre başına 0.5 mikrogram nihai konsantrasyonda oligomisin ekleyin.

Durum üçte solunum yapan hücrelere 0.5 µM FCCP ekleyerek ayrık solunum için de bir ölçüm dahil edin. Her bir RPTC kültür kabına 20 µL 0.5 mM JC-1 çözeltisini yavaşça ekleyin ve boyanın iyice karışması için dairesel hareketlerle sallayın. Kapları 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Ardından, kültürleri buz üzerine yerleştirin ve buz soğukluğundaki PBS ile iki kez yıkama yapın. Sonra hücreleri hasat edin. RPT hücrelerini bir eppendorf tüpüne aktarın ve pipetleme yoluyla monokatmanları tek hücre süspansiyonuna dönüştürün.

488 nanometre argon iyon lazer uyarımı kullanarak floresan analizi akış sitometrisi ile gerçekleştirin. Ardından, izole edilmiş mitokondrilerin mitokondriyal membran potansiyelini hesaplayın. Solunum zincirinin bütünlüğünün değerlendirilmesini kolaylaştırın.

RPTC monokatmanlarının buz gibi soğuk PBS tamponu ile iki kez yıkanmasının ardından, hücreleri toplayın ve santrifüj ile çöktürün. Peleti bir mililitre tampon A ile bir kez yıkayın ve ardından hücreleri, mikroskop altında incelendiğinde homogenattaki hücrelerin çoğu parçalanana kadar bir down homogenizöründe homogenize edin. Daha sonra, düşük hızlı santrifüj ile hücresel kalıntıları uzaklaştırın.

Süpernatandaki ham mitokondrileri 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 ×g ile çöktürün ve çökelmiş mitokondrileri tampon c ile üç kez yıkayın. NADH ubikinon oksidoredüktaz aktivitesini ölçmek için mitokondri pelletini 50 ila 100 µL analiz tamponu içinde yeniden süspande edin ve sıvı azotla dondurun. Analiz tamponuna 500 µL eklemeler ve mitokondriler ekleyin; ayrıca tüm eklemelerin bulunduğu ancak mitokondri içermeyen bir kör numune de ekleyin. Plakayı, karıştırma işlemiyle birlikte 30 °C'de beş dakika boyunca dengeleyin.

Ardından, plakayı spektrofotometreye yerleştirin ve her kuyucuktaki reaksiyonu başlatmak için 10 µL 3.25 mM ubikuinon ekleyin. Absorbansı 340 nm'de, 22 saniyelik aralıklarla üç dakika boyunca kaydedin. Benzer bir analizde, ATP sentaz reaksiyonu için substrat olarak indirgenmiş sitokrom C kullanarak sitokrom C oksidaz aktivitesini ölçün.

Her bir tedavi grubu için toplam APA aktivitesini ve oligomisin duyarsız APA aktivitesini ölçmek üzere karışımları hazırlayın. Örnekleri reaksiyon karışımı içerisinde 31 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. TP substratı ekleyerek reaksiyonu başlatın ve 31 °C'de beş dakika inkübe edin.

İnkübasyon karışımının 200 µL'sini 50 µL üç molar TCA içeren bir tüpe aktarın ve proteinleri buz üzerinde 10 dakika boyunca çöktürün. Ardından santrifüj ile pellete çevirin. Sonrasında, 96 kuyucuklu bir plakaya her bir fosfat standardından 50 µL ve her bir örnek süpernatantından duble şeklinde 50 µL yükleyin.

Ardından her bir kuyucuğa 250 µL Sumner reaktifi ekleyin ve 30 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sonra 595 nm'de absorbansı kaydedin. RPTC monokatmanlarını buz soğukluğundaki PBS tamponu ile iki kez yıkayın.

Hücreleri bir mililitre PBS ile toplayın ve hücre süspansiyonunu bir eppendorf tüpüne aktarın. RPTC örneklerini santrifüj ederek çöktürün ve bir ATP biyolüminesans analiz kiti ile lüsiferaz yöntemini kullanarak TP içeriğini belirleyin. 35 milimetrelik kaplarda hücre canlılığının analizi için; onozis pozitif hücreler, apoptoz pozitif hücreler ve boyanmamış kontrol grubu olmak üzere üç kontrol işlem grubu için beş adet RPTC monokatmanı ve iki adet kap kullanın.

İkinci sete iki µL 50 mM cisplatin ekleyin. İki µL 500 mM tert butyl hydroperoxide ekleyin. Eşlik eden metinde detaylandırıldığı üzere hücreleri propidium iodide kullanarak boyadıktan sonra, monokatmanları bağlama tamponu ile yıkayın.

Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, ZI ile konjuge edilmiş ANNEXIN five kullanarak hücreleri boyayın. Sonra hücreleri nazikçe hasat edin ve 500 µL bağlama tamponu içerisinde süspande edin. Bir kauçuk polisman kullanın.

Hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirmek için bir pipet kullanın ve hücre süspansiyonunu akış sitometrisi tüplerine aktarın. Hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirin. Protein kinaz C epsilon'nun konstitütif aktif ve inaktif mutantlarının CD NA kaplı adenoviral iletimi sonucunda RPTC'lerde ve mitokondrilerde protein kinaz C epsilon protein seviyelerinin önemli ölçüde arttığını belirlemek için vakit kaybetmeden akış sitometrisi ile PI ve FE floresans miktarını ölçün.

Beklendiği üzere, enzimin konstitütif olarak aktif formu RP tcs'lerde fosforile edilmiştir ve dominant negatif enzim fosforile edilmemiştir. Aktif protein kinaz C epsilon varlığı, mitokondrileri enerjilendirmek için kullanılan substrattan bağımsız olarak RPTC'lerde mitokondriyal respirasyonu azaltmaktadır. Ancak inaktif protein kinaz C epsilon'ın mitokondriyal respirasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

İlginç bir şekilde, RP TCS'de protein kinaz C epsilon aktivasyonu, kompleks bir aktivitesini dörtte bir oranında azaltır. RPTC respirasyonundaki bu azalma, mitokondriyal membran potansiyelindeki artışlarla ilişkilidir. Dominant negatif mutantın ise böyle bir etkisi yoktur.

Bu değişikliklere, aktif protein kinaz C epsilon'u aşırı eksprese eden RPTC'den izole edilen mitokondrilerde bir TP sentaz aktivitesindeki azalmalar da eşlik eder. Sonuç olarak, aktif protein kinaz C epsilon'u aşırı eksprese eden RPTC'lerin ATP içeriği azalır; protein kinaz C epsilon'un sürekli aktivasyonu, mitokondriyal fragmantasyon ile kanıtlandığı üzere, mitokondriyal morfoloji üzerinde derin etkilere sahiptir.

Protein kinaz C aktivasyonu, ancak inhibisyonu değil. Ayrıca RPTC morfolojisinde, hücre büzülmesine ve hayatta kalan hücrelerin uzamasına neden olan değişikliklerle sonuçlanır. RPC'lerde aktif protein kinaz C epsilon'un aşırı ekspresyonunun bu mitokondriyal etkileri, hem onkozis hem de apoptozis yoluyla meydana gelen hücre ölümü ile de korelasyon göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, adenoviral teknik kullanarak primer kültürlerde proteinlerin nasıl aşırı eksprese edileceği ve TP sentezi için mitokondriyal kapasitenin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Ve eksiklikleri, adenovirüslerle çalışmanın risk taşıdığını unutmayın, bu nedenle uygun önlemleri almayı ihmal etmeyin.