Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen bir DNA konstrüktünü bakteriyel kromozomda önceden belirlenmiş bir lokusa entegre etmektir. Bu işlem, mühendislik ürünü dört bakteriyel suşu içeren bir çiftleşme protokolü ile gerçekleştirilir. Alıcı suş, kromozomuna entegre edilmiş, ATP bölgeleriyle çevrelenmiş bir speksimisin direnç geni ve e coli beta glukuronidaz geninden oluşan bir iniş pedi dizisine sahiptir.

P JH one 10 donör suşu, bir stuffer kırmızı floresan protein genini çevreleyen iki B bölgesini ve bir antibiyotik direnç genini içeren bir plazmid taşır. PJC two donör suşu, LAC promotör kontrolü altındaki streptomyces faji C 31'e ait bölgeye özgü integrazı içeren bir plazmid taşır. Dördüncü suş olan MT 616, hücreden hücreye plazmid transferi olan konjugasyon için gerekli transfer genlerini sağlar ve alıcı suşlar aracılığıyla translerin oluşumuna yol açar.

İntegrase aracılı kaset değişimi için gerekli olan iki plazmidin edinilmesi. PJ H one 10 plazmidindeki donör kasetin, kromozom üzerindeki iniş pedi kasetinin markörleri ile değişimi, sonuç olarak iniş pedi markörleri olan SPR ve UIDA'nın kaybına ve ortaya çıkan trans-immigrantte donör kaset RFP ve GMR'nin korunmasına yol açar. Bu tekniğin homolog rekombinasyon gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, protokolün kolaylığı ve verimliliğidir.

Ayrıca çok çeşitli bakterilere aktarılabilir. Bu videoda kullanılan alıcı suş bir S. milli suşudur; trans-integrinleri oluşturmak için yapılacak çiftleşme prosedüründen iki gün önce, tek bir koloniden 5 mL spektinomisin içeren TY besiyerine ekim yapın. S. milli suşunu 30 °C'de, çalkalamalı olarak iki gün inkübe edin. Çiftleşme prosedüründen bir gün önce, aşağıdaki E. coli suşlarının her birini, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB sıvı besiyerine ekim yapın: integraz ekspresyon plazmidi içeren DH5$\alpha$ tetrasiklinli besiyerine, mobilizör MT616 kloramfenikollü besiyerine ve donör kaset plazmidi içeren DH5$\alpha$ gentamisinli besiyerine ekim yapın. Üç E. coli suşunu, hücreleri çiftleşme prosedürüne hazırlamak için 37 °C'de sabit çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Dört kültürün her birinden 1,5 mL'yi bir tüpe aktarın ve hücre peletini toplamak için 17.000 $\times$g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin; besiyerini dökün ve her bir hücre peletini 1 mL steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Süpernatantı döktükten sonra tüpleri tekrar santrifüjleyin. Her bir peleti, bir pipet kullanarak 100 $\mu$L steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Her bir suş için yıkanmış kültürden 10 $\mu$L'yi düz bir TY agar plağına ayrı ayrı damlatın.

Bu noktalar kontrol noktalarıdır. Ardından, Pjc two içeren e coli DH five alpha hariç, her bir suşun 40 µL'sini steril bir tüpe ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek karıştırın; bu karışımdan 120 µL'yi düz TY agar plakasına damlatın. Bu nokta, integraz içermeyen negatif kontroldür.

Son olarak, dört suşun her birinden 40 µL'yi steril bir tüpe ekleyip karıştırın ve bu karışımdan 160 µL'yi aynı TDY agar plakasına damlatın. Bu nokta, integraz aracılı kaset değişimi çiftleşme noktasıdır.

Plakayı laminer akışlı kabine yerleştirin ve lekelerin ardından yaklaşık 20 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Plağı mühürleyin ve çiftleşme protokolü çizgisinden bir gün sonra gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. İki kontrol lekesini ve IMCE çiftleşme lekesini, streptomisin ve gentamisin eklenmiş TY agar plaklarına ekleyin.

S milli alıcı suşu, IMCE verimliliğinin hesaplanması için streptomisine karşı yüksek düzeyde direnç sağlayan bir mutasyon taşımaktadır. IMCE çiftleşme noktasının yaklaşık dörtte birini 500 µL steril %0,85 Sodyum klorür içerisinde süspanse edin. 10⁻⁷'ye kadar on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Transmigranları seçmek için 10⁻²'den 10⁻⁵'e kadar olan dilüsyonları, streptomisin, gentamisin ve xgl takviyeli TY agar plaklarına ekin. Hem transmigranları hem de potansiyel alıcıları seçmek için 10⁻³'ten 10⁻⁷'ye kadar olan dilüsyonları, streptomisin ve xgl takviyeli TY agar plaklarına ekin. Toplam alıcıları belirleyin; plakları 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edin.

RFP trans hücrelerini yeşil ışık altında ve kırmızı bir filtre aracılığıyla görüntüleyin; trans göçmenlerin CFU değerini toplam alıcıların CFU değerine oranlayarak yüzde IMCE verimliliğini hesaplayın. Streptomisin ve Gentamisin takviyeli Ty ortamında üç günlük inkübasyon sonrası, trans hücrelerin yaklaşık yarısı gerçek değişime uğrayarak beyazlaşmış ve duyarsızlaşmış olacaktır. Aşağıdaki Kontrol suşlarında büyüme olmamalıdır: integraz kontrol s milli latte UW 2 27 kontrol e coli MT 616 kontrol e coli DH beş alfa P JH bir 10 kontrol içeren ve PJC iki kontrol içeren e coli DH beş alfa. Buna karşılık, çiftleşme noktasından alınan IMCE ekiminde, baş ekimde konfülent büyüme ve ikinci ekimde çok sayıda koloni görülmelidir. Sonraki iki görüntü, çiftleşme noktasının 10 üzeri negatif iki dilüsyondan hazırlanan resüspansiyonlarını TY streptomisin xgl agarda ve TY streptomisin Gentamisin xgl agarda göstermektedir.

Mavi koloniler tekil rekombinantlardır. Beyaz koloniler ise gerçek kaset değişimine uğramış trans integrinlerdir; yeşil ışık altında ve kırmızı filtre aracılığıyla bakıldığında, TY strept cin xgl agardaki çiftleme spot resus süspansiyonunun negatif iki dilüsyonu floresans göstermez. Buna karşılık, Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agardaki çiftleme spot resus süspansiyonunun 10⁻² dilüsyonu iki seviyeli floresans gösterir.

Daha parlak kolonlar mavi kolonlara karşılık gelir ve muhtemelen vektördeki LAC promoterından bir okuma geçişi (read-through) olduğu için daha yüksek RFP ekspresyonuna sahiptir. Daha az parlak olan kolonlar ise gerçek kaset değişimi geçirmiş ve yalnızca kendi yakın promoterını içeren RFP'ye sahip olan ve LAC promoterından okuma geçişi gerçekleşmeyen beyaz kolonlara karşılık gelir. Bu eğilimlerdeki kolonların aynı zamanda specks mycin duyarlı olması gerekir.

Toplam alıcıların trans göçmenlere yüzdesi olarak ifade edilen trans entegrasyon verimliliği %0,5 aralığında olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, DNA konstrüktlarını bakteriyel kromozoma yerleştirmek için mühendislik ürünü suşlarımızı kullanarak bakteriyel konjugasyonun nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.