Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, etanol maruziyetinin gelişmekte olan zebra balığı üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle erken gelişim aşamasındaki zebra balıklarının normal embriyo suyu içerisinde etanol dozlarına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, etanol ortamdan uzaklaştırılır ve balıkların istenen zaman noktasına kadar gelişmesine izin verilir.

Ardından, kontrol embriyolarıyla karşılaştırıldığında, işlem görmüş embriyolarda hem genel fiziksel değişimler hem de gen ekspresyonundaki değişiklikler analiz edilir. Son olarak, etanolle tetiklenen gelişimsel kusurların değiştirilip değiştirilemeyeceğini belirlemek için embriyolar mRNA, morfolantlar veya ilaçlarla manipüle edilir. Nihayetinde, kantitatif PCR ve in situ hibridizasyon kombinasyonu, etanolün gelişmekte olan zebrafish embriyoları üzerindeki etkilerinin gen ekspresyonu değişikliği ile bağlantılı olduğunu gösterir.

Gen ekspresyon seviyelerinin sonradan manipüle edilmesi, etanol kaynaklı gelişimsel kusurları iyileştirebilir veya önleyebilir. Bugün göstereceğimiz teknikler, fötal alkol sendromunun doğasına ilişkin bilgilerimizi genişletmenin yanı sıra omurgalılardaki gelişim süreçlerini korumaya yardımcı olur. Embriyoların etanolle nasıl işlem göreceğini bugün laboratuvarımdaki teknisyen Steph Erhardt gösterecek.

Yaban tipi çiftleşmelerden elde edilen embriyoları, embriyo suyunda 28 °C'de kubbe evresine kadar büyütün. Bir yumurta grubundaki embriyoları, her kapta 10 ile 50 embriyo olacak şekilde istenilen sayıdaki kaba paylaştırın. Embriyoların üzerine, balık suyunda hacimce %0,2 ile %2,5 arasında etanol çözeltisi ekleyin ve istenen maruziyet süresinden sonra embriyoları en fazla 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Kantitatif PCR için mRNA toplamak amacıyla, gelişimin belirli bir dönemi boyunca etanol içeren suyu taze embriyo suyu ile değiştirin. H eşleşmiş embriyoları eppendorf tüplerine yerleştirin. Balık suyunu uzaklaştırın ve TCEP içeren lizis tamponu ekleyin.

Motorlu bir pulverizatör kullanarak embriyoları fiziksel olarak ayrıştırın ve ardından düşük hızda santrifüjlemek için santrifüje yerleştirin. Çözeltiyi bir ön temizleme kolonuna aktarın, ardından kolonu santrifüjleyin. Bu işlem, ayrışmış büyük parçaları uzaklaştırmak içindir.

RNA'yı ekstrakte etmek için bir RNA izolasyon kiti kullanın. Ardından, embriyoları in situ hibridizasyon ve antikor boyamasına hazırlamak için QPCR veya mikroarray analizi için standart yöntemleri kullanarak cDNA sentezleyin. Fertilizasyondan sonraki 6 ila 24 saatlik embriyoları, %4 paraformaldehit içinde dört derece Celsius'ta gece boyunca sabitleyin ve ardından PBS artı %0,1 tween ile üç kez yıkayın.

Mikroskop altında, iki adet keskin penset kullanarak koonu çıkarın. Ardından, artan metanol konsantrasyonu ve azalan PBT konsantrasyonu içeren bir dizi sıvı değişimi ile embriyoları metanole aktarın. Embriyolar %100 metanole aktarıldıktan sonra, kıkırdağı boyamak için -20 °C'de saklayın.

Embriyoları döllenmeden sonra beş veya altı günlük olana kadar büyütün. Bunları dört derece santigrat sıcaklıkta %4'lük paraformaldehit içerisinde gece boyunca sabitleyin. Ardından, etanol maruziyeti nedeniyle hangi gen ekspresyon seviyelerinin değiştiğini belirlemek için onları üç kez PBT ile yıkayın.

Öncelikle primerleri doğrulamak için primer tasarımı yaparak QPCR gerçekleştirin. Bunları üç biyolojik örnek üzerinde test edin. Bu kontrol biyolojik örnekleri, ilgilenilen genin söz konusu yaşta ifade bulması koşuluyla herhangi bir yaşta olabilir.

Primerler doğrulandıktan sonra, örneklerin üçlü setler halinde çalıştırıldığı ve zebrafish kontrolü için bir kontrol örneğinin dahil edildiği QPCR işlemini gerçekleştirmek üzere önceden hazırlanmış CDNA'yı kullanın; kontrol için gap dh primerlerini kullanıyoruz. Sonuçları gap DH seviyelerine göre normalize edin. Ardından, güçlü yöntemini (powerful method) kullanarak gen ekspresyonunun bağıl düzeyini hesaplayın.

Yabanı tipe göre deneysel farkı gösteren iki delta delta CT üzerindeki varyasyon. C'de iki hibridizasyon konstrüktü. İlgi duyulan gene yönelik işaretli ribo problar.

Ardından, bunları standart koşullar kullanarak yaşdaş embriyolarla inkübe edin ve hibridizasyon paternini alkalin fosfataz ile tespit edin; morfojenik gelişimi, örneğin kafa şeklini değerlendirmek için örnekleri bir diseksiyon mikroskobuyla görüntüleyin; interoküler mesafeyi ve vücut uzunluğunu değerlendirmek için canlı embriyoları görüntüleyin. İlk olarak, embriyoları paraformaldehit ile sabitleyin. Ardından, alkol işleminin larva evresindeki gelişmekte olan kıkırdak yapıları üzerindeki etkilerini incelemek için görüntüler toplayın.

Görüntüleme öncesinde embriyoları sabitlemek ve şeffaflaştırmak için zebrafish'leri birkaç saatten gece boyunca lc ve mavi ışık altında bekletin. Canlı embriyolardaki hücre ölümünü analiz etmek için embriyoları PBS içerisinde 5 mg/mL akridin oranj çözeltisinde bir saat boyunca inkübe edin. Embriyoları PBS ile üç kez yıkayın, ardından embriyoları lamlara monte edin, örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin ve kompozitler oluşturmak için Z serisi görüntüleme yapın.

Etanol maruziyeti nedeniyle ekspresyonu azalmış genler belirlendikten sonra, hedef gen için 25 ila 200 picogram/nanolitre miktarında capped mRNA, bir ila iki hücreli evreye enjekte edin. Yumurtaların, dome evresine ulaşana kadar 28 °C'ye ısıtılmış bir inkübatörde toparlanmasını sağlayın ve ardından daha önce olduğu gibi etanol ile işlem uygulayın. Etanol maruziyeti sonucunda ekspresyonu artan genler için, bir ila iki hücreli evredeki embriyolara picogram ila nanogram miktarlarında antisense morpho enjekte ederek bunları nakavt edin.

Bu protokol, kaplı mRNA protokolüne benzerdir. Eğer bir mRNA veya splicing morpholino enjekte ediliyorsa, doz bağımlı gen aktivitesini analiz etmek için spliced ve unsliced transkript miktarlarını karşılaştırmak amacıyla R-T-P-C-R kullanarak verimliliği ölçün, enjekte edilen morphinoyu titre edin ve embriyoları etanol ile tedavi etmeden önce istenen aşamaya kadar gelişmelerine izin verin. Zebra fish embriyolarının etanola maruz kalması, diğer omurgalılarda bulunan fenotiplerle ilişkili bir dizi gelişimsel ve genetik defekt ile sonuçlanır.

Noor dahil olmak üzere aksiyel dokuların anormal gelişimi, noord'un kısalmasına ve zaman zaman bozulmasına yol açar; bu durum kısmen, burada gösterildiği üzere somitlerdeki daha sonraki anomalilere neden olur. İşlem görmemiş kontroller belirgin bir chevron şekline sahipken, etanol ile işlem görmüş somitler, azalmış sonic hedgehog sinyalleşmesinde görülen U şekilli görünümü alır. Burada görüldüğü gibi.

Etanol maruziyetinin, muhtemelen erken gelişimsel gecikme ve ardından gelen Noor defektlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan bir diğer sonucu ise embriyo uzunluğunun kısalmasıdır. Bu bulgu, gelişim sırasında etanole maruz kalan çocuklarda görülen ergenlik öncesi dönemin uzaması ve kısa boyluluk durumuyla benzerlik göstermektedir; bu da zebrafish modelinin, bu insani doğum kusurunun anlaşılması açısından uygun olduğunu göstermektedir. Hayvan modellerinde, şiddetli etanol maruziyetinin synthia ve opia dahil olmak üzere belirgin fetal alkol sendromu fenotiplerine yol açtığı kanıtlanmıştır.

Zebrafishlerde, intraoküler mesafe veya IOD, insan doğum kusurunun doğasıyla tutarlı bir şekilde etanol dozuna bağımlı olarak azalır. Opia yalnızca çok yüksek dozlarda görülür, ancak daha düşük dozlar IOD'de anlamlı bir azalmaya neden olur; bu da söz konusu hayvan modelinin orta hat yüz gelişiminde benzer bir kusura sahip olduğunu göstermektedir. Bu şekilde, tedavi edilmemiş ve etanol uygulanmış embriyolarda six3B ve gli1'in erken gen ekspresyon seviyeleri karşılaştırılmıştır.

Her iki gen, etanolle işlem görmüş örneklerde azalmış ekspresyon seviyeleri göstermiştir. NC iki hibridizasyon kullanılarak, six3B ve gooID genlerinin ekspresyon paternleri görüldüğü şekilde analiz edilmiştir. Burada, etanolle işlem görmüş embriyolarda her iki genin uzaysal ekspresyonu, işlem görmemiş kontrollere kıyasla azalma göstermiştir.

Her iki gen de kraniofasiyal orta hat dokularına dönüşecek dokularda eksprese edildiğinden, döllenmeden sekiz saat sonra bu genlerin azalması, gelişimin ilerleyen aşamalarında IOD'deki azalma ile tutarlıdır. Etanolden etkilenen genler belirlendiğinde, bu genlerin ekspresyonunun artırılabileceği veya azaltılabileceği mekanizmalar mevcuttur. Bu örnekte, gliy protein 1 seviyelerini artıran bir ligand olan sonic hedgehog için mRNA enjekte edilmiş ve bu işlem, gliy protein 1 azalmasına ve etanol tedavisine bağlı kaba defektleri düzeltmiştir.

Bununla birlikte, six three B enjeksiyonu, etanolle maruz bırakılmış fenotipi kurtaramamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan bir zebrafish embriyosunda etanolün neden olduğu genetik ve gelişimsel kusurların nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Burada kullanılan teknikler, gelişmekte olan omurgalı embriyolarda diğer suda çözünür bileşiklerin toksisitesini çalışmak isteyenler tarafından da uygulanabilir.