Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, stromal fibroblastların epitelyal hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini analiz etmek amacıyla, üç boyutlu karışık hücreli doku kültürlerinden epitelyal hücreler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle üç boyutlu karışık hücreli steroid ko-kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ko-kültür sonrası epitelyal hücreleri izole etmek için sferoitler matriks kültüründen ayrılır.

Bir sonraki adım, ortak kültür sonrası epitel hücreleri analiz için hazır hale gelene kadar pasajlamaktır. Nihayetinde, üç boyutlu kültürde fibroblastlara maruz kalmanın epitel hücre davranışı üzerindeki etkileri, kültürlerin mikroskobik görüntülemesi ve ortak kültür sonrası analizlerle değerlendirilebilir. Burada gösterilen matris invazyonunun floresan görüntülemesi ve Transwell migrasyonu gibi epitel hücre analizleri gerçekleştirilecektir. Prosedürü, ortak kültürlerin kurulduğu günden bir gün sonra, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Quinle gerçekleştireceğiz.

Matrigel'i dondurucudan çıkarın ve bir gece boyunca dört derece Celsius'luk bir buzdolabında buz üzerinde çözdürün. Deney günü, kültür ortamını Matrigel ile karıştırmadan en az bir saat önce buz üzerine yerleştirin. Çözdürülmüş Matrigel'i seyreltmek için.

Buz üzerinde bulunan steril bir tüpe, ko-kültür için gerekli olan buz soğuk H Mac ortamı hacminin yarısını ekleyin. Ardından, tüpü buz üzerinde tutmaya devam ederek, bire bir dilüsyon elde etmek için çözülmüş matrigel'den aynı miktarda (toplam hacmin yarısı kadar) ekleyin. Sonrasında, 24 kuyucuklu bir plakanın belirlenen kuyucuklarının ortasına 50 µL matrigel ortam karışımı yerleştirin ve plakayı nemlendirilmiş hava ve %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, kuyucuklara 450 µL ek matrigel ortam karışımı ekleyin ve 60 dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyon sırasında, her 0,5 mL HM medyumunda 0,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda fibroblast ve epitel hücrelerinden oluşan bire bir süspansiyon hazırlayın. Matrigel ortam karışımı katılaştığında, hücre süspansiyonunu nazikçe jelin üzerine damlatın ve kültürü iki gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Besiyerini her iki ila üç günde bir, kuyucuğun kenarından çok nazikçe aspire ederek ve yerine taze HEC besiyeri ekleyerek değiştirin; sferoid oluşumunu mikroskop altında günlük olarak ve uygun şekilde ışık veya floresan mikroskopisi kullanarak izleyin. Kültürü, steril iki mililitrelik bir cam pipet kullanarak 10 kez yukarı aşağı pipetleyerek işleme başlayın. Ardından kültürü cam pipetle steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 350 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası hücresel sferoid tüpün dibine çökecektir.

Santrifüjün üst kısmındaki parçalanmış matrigel tabakasını nazikçe uzaklaştırmak için steril bir pastör pipeti ucu kullanın. Hazırlama. Şimdi, peletlenmiş steroid pipetine 1 mL H mac medyumu ekleyin ve steril 2 mL'lik bir cam pipetle iki üç kez aşağı yukarı hareketlerle karıştırın, ardından kültürü 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki bir kuyucuğa aktarın. Medyumu değiştirmeden önce steroidin kaba tutunması için en az 48 saat bekleyin.

Zamanla, hücre kültürleri %50 konfluense ulaştığında, hücreler sferoid yapıdan ayrılacak ve monokatmanlar halinde büyüyecektir; hücrelerin daha ileri analizlerinden önce, bir standardizasyon protokolü kullanarak onları 35 mm'lik bir kaba iki ila dört günlüğüne ve ardından 100 mm'lik bir kaba üç ila beş günlüğüne pasajlayın. Besiyerini aspire etmek için steril bir pastör pipeti kullanın ve ardından kalan sferoidleri mümkün olduğunca manuel olarak uzaklaştırın. Üç boyutlu sferoid ko-kültürlerinde, burada şekil D, E ve F'de gösterildiği gibi mühendislik yoluyla TM1 susturması yapılan fibroblastlar, şekil A, B ve C'deki kontrol fibroblastlarına kıyasla meme epitel hücrelerinin matrisle etkileşimini ve invazyonunu artırır. Şekil D ve F'de oklarla belirtildiği gibi, TM1 susturulmuş fibroblastları içeren sferoidlerde matrise doğru ilerleyen epitel projeksiyonlarına dikkat edin. Burada şekil J, K ve L'de gösterilen mühendislik yoluyla TM1 aşırı ekspresyonuna sahip fibroblastlar, şekil G, H ve I'deki kontrol fibroblastlarına kıyasla meme kanseri hücre hattı SUM159 tarafından gerçekleştirilen invazyonu azaltmıştır. Ko-kültür sferoidleri oluşturulduktan sonra, TM1 mühendisliği yapılmış fibroblastlar içeren sferoidlerdeki epitel projeksiyonlarının yokluğunu, şekil G ve I'deki oklarla belirtilen kontrol fibroblastları içerenlerle karşılaştırın.

Hücre popülasyonları, iki boyutlu bir ortamda yeniden ekim yapılarak steroidlerden izole edilebilir. Bu kompozit görüntüler, matrigel kültüründen izole edildikten sonra ışık ve floresan mikroskopu altındaki kültürleri göstermektedir. Sıfırıncı gün, izolasyonun hemen ardından yapılan görüntülemeyi; birinci, ikinci ve beşinci günler ise izolasyondan sonraki günleri temsil etmektedir.

Bu steroidden ayrılan hücre koronasının zamanla nasıl arttığına dikkat edin. Sonunda, burada okla vurgulandığı gibi, çok az hücrenin kaldığı bir hayalet steroid kalır. Hayaletlerin uzaklaştırılması ve bir pasajdan sonra çok az steroid kalır.

Test edilen hücrelerin göreceli büyüme hızlarına bağlı olarak, seri pasajlama yoluyla saf popülasyonlar elde edilebilir veya uygun hücre belirteçleri kullanılarak ayırma işlemi yapılabilir. Bu örnekte, epitel ve fibroblast hücrelerinin göreceli popülasyonlarını belirlemek amacıyla; GFP eksprese eden fibroblastları ve mCherry eksprese eden epitel hücrelerini sırasıyla tanımlamak için yeşil floresan ve kırmızı floresan kullanılarak akış sitometrisi ile örnek analizleri gerçekleştirilmiştir.

3D ko-kültürden izolasyon sonrası epitel hücreler, fibroblastlarla yapılan ko-kültürün kazandırdığı özellikleri uzun süreler boyunca korurlar ve bu durum analiz için geniş bir imkan sağlar. Bu örnekte, TM one eksik fibroblastlara maruz kalma, ko-kültürdeki H max hücrelerinde, burada C olarak etiketlenen kontrol fibroblastlarına maruz kalmaya kıyasla, 3D ko-kültürden izolasyondan sonra haftalarca devam eden artmış migrasyona neden olmuştur. Bu prosedürün ardından, fibroblastların epitel hücreler üzerindeki etkilerine dair ek soruları yanıtlamak amacıyla gen ekspresyonundaki ve epigenetik işaretlerdeki değişiklikleri analiz etmeye yönelik diğer yöntemler uygulanabilir.