Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu deneyin amacı, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünden sorumlu olan geni veya genleri belirlemektir. Bu işlem, öncelikle organel floresan markörü taşıyan atopi tohumlarına mutajen olarak kimyasal bir ajan olan etil metan sülfonat eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise, sonraki mutant nesil M2'nin hatlarını yetiştirmek amacıyla, ilk mutajen neslin tekil bitkilerinden tohum toplamaktır.

Ardından, aberrant organal fenotipi belirlemek için mutagen a Eliana tohumları konfokal veya floresan mikroskop kullanılarak gözlemlenir. Son adım, üçüncü mutagen neslin oluşturulması ve mutant fenotipin varlığının doğrulanmasıdır. Nihayetinde, resesif mutasyon yeni nesil dizileme araçları kullanılarak haritalanabilir.

Mutant genin konumu belirlendikten sonra, yabanıl tip gen ile transformasyon, anormal organel fenotipini düzeltmelidir. Bu yöntem, bitki organellerinin morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Atil metanlar, atop sta tohumlarının sülfonatla işlenmesi, genomda sitozin zamanlama değişikliklerini tetikleyerek sitozin gwan'dan zamanlamaya yol açar.

Mutasyonların eklenmesi. M2 bireylerinde mükemmel bir mutasyon oranı sağlamak için EMS uygulaması bu protokolün temel bir adımıdır. Başlamak için, daha önceden ilgili bir organel floresan işaretçisi taşıyacak şekilde mühendisliği yapılmış olan yabani tip Columbia ekotipi Arabidopsis tohumları temin edin.

0,8 gram veya yaklaşık 40.000 tohumu 50 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Ardından 25 mililitre distile su ve %0,2 etil metan sülfonat ekleyin. Karışımı, düşük hızda çalışan bir mutasyon karıştırıcısında 16 saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından sıvıyı aspire edin ve bir molar sodyum hidroksit içeren bir erlene boşaltın.

EMS'yi inaktive etmek için, tohumları içeren Falcon tüpüne 25 mililitre su ekleyin. Tüpü kapatın ve tohumları yıkamak için beş kez ters çevirin. Tüm tohumlar çöktükten sonra, suyu aspire edin ve bir molar sodyum hidroksit balonuna boşaltın.

Bu yıkama adımını 10 kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra, tohumları minimum miktarda su ile süzün. 25 mililitre %10'luk çamaşır suyu ekleyip 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayarak tohum sterilizasyonuna geçin. Tohumlar dibe çöktüğünde, çamaşır suyunu dökün ve 25 mililitre steril su ile durulayın.

Steril su uzaklaştırıldıktan sonra, 25 mililitre %70 etanol ekleyin. Tüpleri 30 saniye boyunca çalkalayın ve tohumların dibe çökmesini bekleyin. Etanolü dökün ve 25 mililitre steril su ile durulayın.

Steril su ile yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Ardından tohumları, içinde üç mm filtre kağıdı bulunan plastik bir Petri kabına dökün. Tohumları dört °C'de iki gün boyunca inkübe ettikten sonra çeker ocak altında kurumaya bırakın.

Tohumları, jelleştirici madde olarak Phytagel içeren yarı Magi ve Scoog besiyerine, plaka başına yaklaşık 250 ila 300 tohum olacak şekilde 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. M1 neslinden gelen tohumları plakalar üzerinde iki hafta boyunca büyütün. Fideleri toprağa aktarın ve bitkilerin büyümeye devam etmesini sağlayın.

30 ila 45 gün sonra, bitkiler sızıntıların net bir şekilde görülebileceği olgunluk evresine ulaşacaktır. Bu noktada, 1000 bağımsız M2 hattı oluşturmak için her bir M1 bitkisinden M2 tohumları toplayın. Fideleri konfokal veya floresan mikroskop altında gözlemlemek için, her M2 hattından 60 tohumu plastik Petri kaplarında yarı konsantrasyonda besiyerinde yedi ila 10 gün boyunca yetiştirin.

Fighter gel içeren Moreish ve scoog besiyerinde, aynı plaka üzerinde EMS ile işlem görmemiş beş adet kontrol fidesini de büyütün. Fideler büyüdüğünde, beş ila 10 adet cos lead-in'i, ABAC mühür tarafı mikroskop lamı üzerindeki 40 kat gücündeki lensle karşı karşıya gelecek şekilde yerleştirin ve bir lamla kapatın; floresan altında, her bir oleini kortikal bölgeden medial bölgeye kadar organel işaretçisinin değişmiş hücre altı dağılımı açısından gözlemleyin. Pozitif bitkilerin toprağa naklinin ardından fideleri az önce tarif edildiği gibi büyütün ve mutant fenotipin M3 neslinde olduğunu doğrulayın.

Yazılı protokolde açıklandığı üzere, istenen organel floresan markörünü içeren bir yabani tip genomu ile en az üç kez geri çaprazlama yaparak kontamine arka plan mutasyonlarını giderin. Haritalamaya başlamak için, homozigot mutant Columbia DNA'sını temsil eden M3'ten yaklaşık üç mikrogram genomik DNA ekstre etmek için cogen DN Easy Z plant mini kit kullanın. Bu DNA'yı Illumina genome analyzer two 14 sekanslamasına gönderin.

Bir sonraki adım, kendi kendine tozlaşma sonrası kombinasyonun gerçekleşebileceği F1 dölünü elde etmek için zago mutant Colombia hattını Las Berger ile çaprazlamaktır. Oluşacak F2 nesli, nihayetinde mutasyona neden olan ilgili geni içeren bir haritalama popülasyonu olarak hizmet edecektir. Bu popülasyonun genomik DNA'sı ile yabani tip bitkilerin genomik DNA'sı karşılaştırılarak, mutasyonun genomdaki konumu belirlenebilir.

F2 bitkilerinin büyümesinin ardından, aberan fenotip gösteren 70 ila 100 arasında F2 bireyi ve aynı sayıda yabanıl tip fenotipli F2 bitkisi toplayın ve bir delgeç kullanarak her bitkiden bir yaprak diski alın. Yaprak diski, aynı yaştaki yapraklardan toplanmalıdır. Benzer miktarlarda DNA elde etmek için örnekler, genomik ekstraksiyon için ayrı ayrı veya gruplar halinde işlenebilir.

Bu durumda, genomik DNA'nın çıkarılması gereken tüp sayısını azaltmak için her bir eend orph tüpü başına beş ila 10 örnek toplanabilir. Genomik DNA'yı çıkarmak için master pure plant leaf DNA purification kiti kullanın. Her bir örnekten elde edilen genomik DNA daha sonra NanoDrop ile miktarlandırmasına tabi tutulabilir.

Ardından, işaretleme reaksiyonunu gerçekleştirmek için mutant ve vahşi tip örnekleri ayrı tutarak, her örnekten toplam 300 nanogram olacak şekilde eşit miktarda DNA birleştirin; önce 60 mikrolitre 2,5 x rastgele primer çözeltisi ve 42 mikrolitre su ekleyin. DNA'yı beş ila 10 dakika boyunca 95 degrees Celsius'nin üzerinde denatüre ettikten sonra, DNA'yı denatüre etmek için örnekleri buz üzerinde soğutun. 15 mikrolitre 10 X DN tps ekleyin.

Biyotin DCTP ile karıştırın ve üç mikrolitre Glen polimeraz ile tamamlayın. Örnekleri 25 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, 15 µL 3 M sodyum asetat ve 400 µL soğuk %100 Ethanol ekleyin. Karıştırılan örnekleri, 20.500 ×g'de 15 dakika santrifüj ettikten sonra -80 °C'de bir saat inkübe edin. İkinci bir döndürme işleminin ardından pellet'i 500 µL soğuk %75 ethanol ile yıkayın.

DNA peletlerini 37 °C'de 10 dakika boyunca kurutun. Peletleri 100 µL su içerisinde yeniden süspande edin ve verim ile kaliteyi bir jel üzerinde kontrol etmek için beş µL kullanın. Rastgele işaretleme reaksiyonlarının primerleri, yabani tip F2 bitkileri havuzundan ve mutant F2 bitkileri havuzundan alınan örneklerle %1'lik agaroz jele yüklendi.

Son adım olarak, gen çipi arabidopsis ath one genom dizisi hibridizasyonu için vahşi tip ve mutant işaretleme reaksiyonundan 95 µL gönderin. Tarayıcı taramayı tamamladıktan sonra, elde edilen nokta CL dosyaları yazılımımız kullanılarak analiz edilir. Yazılımımız yüklendikten sonra, programı açın ve yazılı prosedürde bulunan bioconductor dizisini yapıştırın.

Ardından, dizi, genotipleme ve haritalama web sitesinden standart BIOCONDUCTOR paketlerini yükleyecek olan enter tuşuna basın. Metinde listelenen dosyaları indirin ve masaüstünde yeni bir klasöre çıkartın. Gen çipi deneyinden elde edilen verileri wild type C, L ve mutant C şeklinde tutun. Şimdi, wild type C ve mutant C için gen çipi verilerini klasöre kopyalayın.

Ardından, PC için R'yi açın. Dosya'ya tıklayın ve ardından dizini değiştir'e tıklayın. Dosyaları içeren klasörü seçin, çalışma alanını yükle dosyasına tıklayın ve ardından A one V five R data open read C do R'yi seçin; Notepad kullanarak açın ve tüm metni R'ye kopyalayın; Mac için, mis'e tıklayın ve ardından çalışma dizinini değiştir'e tıklayın.

Dosyaları içeren klasörü seçin. Çalışma alanını yükle (workspace load workspace file) seçeneğine tıklayın ve ATH one V five R data dosyasını seçin. Benzer şekilde, hem SFP R hem de MAP R dosyalarını bir metin düzenleyici ile açın ve metni R konsol penceresine kopyalayın.

Arabidopsis bilgi kaynağında veya TAIR'da gen araması yapmanız için bir mesaj görünecektir. Metinde bulunan bağlantıyı kopyalayıp internet tarayıcısına yapıştırın. Dosyayı açmanızı veya kaydetmenizi isteyen bir pencere açılacaktır.

Kaydet'i seçin. Bir dosya adı belirleyin ve uzantısını ekleyin. x ls işlemini yapın.

Ardından kaydet'e tıklayın. Burada beklenen tipik bir sonuç gösterilmiştir. Gen çipi Arabidopsis H1 genom dizisinden elde edilen veriler analiz edildikten sonra, bu şekil, yatay çubukların tespit eşiklerini temsil ettiği, gen çipi Arabidopsis, H1 genom hibridizasyonu kullanılarak yapılan Columbia sıfır mutasyonunun haritalanmasına dair bir örneği temsil etmektedir.

Bu örnekteki mutasyon, dikey çubuklarla sınırlandırılmış birinci kromozom üzerinde yer almaktadır. Haritalanmış alan içindeki mutant koordinatını bulmak için dot XLS dosyasını açın. Mutant genomun birleştirilmiş Illumina okumaları arasında, tek nükleotid polimorfizmleri arasından spesifik EMS geçişlerini belirleyin.

Bu yaklaşımda uzmanlaşıldığında, bu protokolde açıklanan yöntem, klasik haritalama yöntemine kıyasla çok daha kısa bir zaman diliminde gen haritalaması yapmak için kullanılabilir.