13 Şubat 2013
Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir C. elegans. Bu yöntem, bu tür DBL-1/TGF-β sinyalleme yoluyla vücut boyutu düzenlenmesinde yer alan bu gibi muhtemel ilgi genetik bileşenler, belirlemek için büyük ölçekli bir ekran için kullanılabilir.
Bu video, *C. elegans* büyümesini ve vücut boyutunu düzenleyen genlerin tanımlanmasına yönelik bir prosedürü göstermektedir. Aday genleri inaktive etmek için RNA interferansı veya RNAi kullanılarak, öncelikle hedef genleri hedefleyen çift zincirli RNA eksprese eden bakteriler içeren plaklar hazırlanır. Dördüncü larval evredeki hermafroditler RNAi plaklarına aktarılır.
Genç yetişkin aşamasına ulaştıklarında, yumurta bırakmaları için yeni RNAI plakalarına aktarılırlar. Birkaç saat sonra, senkronize embriyo popülasyonları bırakılarak ortamdan uzaklaştırılırlar. Gelişimin istenen aşamasında, yavrular toplanır ve lamlara monte edilir.
Son olarak, solucanların mikroskobik görüntüleri elde edilir. Görüntü analizi, gen inaktivasyonunun neden olduğu vücut boyutundaki değişiklikleri ortaya koyar. Bu yöntem, TGF beta sinyal yolu regülatörlerini tanımlamak için kullanılabileceği gibi, insülin sinyal yolu gibi C. elegans'taki embriyo sonrası gelişimi düzenleyen diğer yollara da uygulanabilir.
Bu prosedüre, hedef gen dizilerini yaygın olarak kullanılan bir solucan RNAi plazmidi olan L 4 4 4 0 A vektörüne klonlayarak ve ardından rekombinant plazmidi bakteriyel suş HT one 15 DE three kültürüne transforme ederek başlayın. Transforme edilen bakterileri, 25 µg/mL kanamisin ve 12,5 µg/mL tetrasiklin içeren LB agar plaklarında büyütün, ardından gelecekte kullanmak üzere tek bir klon seçin.
Bu sırada, boş vektör L 4 4 4 0'ı bakteriyel suş HT one 15'e transforme edin. Deneyler için kontrol olarak kullanmak üzere, transforme edilen bakterileri 100 µg/mL ampicillin içeren 1 mL LB besiyerinde 37 °C'de gece boyunca kültüre edin.
RNAI verimliliğini düşürdüğü için tetrasiklin eklenmez. Gece boyunca büyütülen kültüre, mililitre başına 100 mikrogram ampisilin içeren beş mililitre daha LB besiyeri ekleyin ve ardından 37 °C'de dört ila altı saat daha inkübe edin. Kültür hazır olduğunda, uygun klon adı ile etiketlenmiş RNAI solucan plaklarına 0,5 mililitre deneysel veya kontrol bakterisi ekin.
Her bir koşul için en az iki plaka hazırlanmalıdır. Plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.
Hedef gen dizisi içeren veya içermeyen RNAi eksprese eden bir bakteri çimi hazır olmalıdır. Hayvanlar, bakterileri besin kaynağı olarak kullanacaktır. RNAi besleme plakaları hazır olduğunda, bir platin telin ucunu alevle sterilize edin.
Ardından, her bir RNAi plağına altı ila on adet dördüncü larval evre veya L4 C. elegans hermafroditi aktarmak için platin teli kullanın. Hermafroditlerin 20 °C'de gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, hayvanlar genç yetişkinler olacaktır.
Bunları yeni, uygun şekilde etiketlenmiş ve hazırlanmış bir RNAI plakasına aktarın. Erişkinlerin yumurta bırakmalarına izin vermek için plakaları 20 °C'de dört ila altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dövüleri senkronize etmek için tüm erişkinleri plakadan uzaklaştırın.
Yetişkinler alındıktan sonra süreyi saymaya başlayın. Bu, sıfırıncı zamandır. Hayvanların ilgili gelişim evresine gelmelerini sağlamak için plakaları 20 °C'de inkübe edin.
Burada, fenotipik analiz için genç yetişkinler seçilecektir. Normal hızda gelişen knockdownlar için 72 saatlik inkübasyon gereklidir. Çeşitli genlerin hayvan gelişimini farklı şekilde etkilediğini, bu nedenle inkübasyon sürelerinin ayarlanması gerekebileceğini unutmayın.
RNAi hayvanların farklı bir hızda büyümesine neden olursa, genç yetişkinler; burada gösterildiği gibi VUL gelişimi tamamlanmış, uterusta iki ila altı embriyo bulunan ve L4 evresini geçeli 24 saatten fazla olmamış bireyler olarak tanımlanabilir. Diğer gelişim evrelerini belirlemek için araştırmacı, gonadal ve VUL gelişimini kılavuz olarak kullanmalıdır. Hayvanlar uygun evreye ulaştığında, RNAi uygulanmış solucanların vücut büyüklüğü fenotiplerini puanlamak için hazırlık yapın.
Ardından, burada gösterildiği gibi, bir milimetre kalınlığındaki cam lam üzerine iki kat renkli etiket bandı yapıştırın. Bu lamlardan iki adet hazırlayın. Daha sonra, bantlı iki lamın arasına yeni bir cam lam yerleştirin ve su içinde eritilmiş %2 Agros'tan bir damla damlatın.
Yeni lamın merkezine, ince bir agar pedi oluşturmak için üzerine ikinci bir lam bastırın. Agar katılaştığında, üstteki lamı kaldırın. Agar pedli lam, solucanların yüklenmesi için hazırdır.
Lamı klon adıyla etiketleyin. Aros pedine 10 µL 25 mM sodyum azid ekleyin. Ardından, daha önce olduğu gibi bir platin tel kullanarak 30 ila 40 hayvanı sodyum azid solüsyonuna aktarın.
Hareketsiz hale getirmek için üzerlerine bir lameli yerleştirin. Bu işlemi hem rekombinant hem de RNAi işlemi görmüş boş L 4 4 4 0 taşıyan hayvanlar için yapın. Ardından, mikrometre lamini 2,5 x objektif lensli bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
Q Capture veya benzeri bir yazılım kullanarak mikrometre cetvelinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin. Ardından solucanları mikroskobun altına yerleştirin ve görüntülerini yakalayın. Önce vücut uzunluğunu ölçmek için, mikrometre cetvelinin görüntüsünü Image Pro yazılımında açın.
Ardından ölçüm (measure) sekmesine tıklayın ve kalibrasyonu (calibration) seçin. Sonra, aktif görüntüyü kalibre et (calibrate the active image) seçeneği işaretliyken uzamsal kalibrasyon sihirbazını (spatial Calibration wizard) seçin. İleri (next) butonuna tıklayın.
Kalibrasyon için ismi girin ve uzamsal referans birimlerinin mikron olarak ayarlandığından emin olun. Ardından Referans kalibrasyonu oluştur düğümünü işaretleyin ve İleri'ye tıklayın. Referans hattını çiz seçeneğine tıklayın.
Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Ölçek çubuğunu mikrometrenin uçlarıyla eşleşecek şekilde yeniden konumlandırın. Ardından, referansın 1000 birimi belirttiğini işaretleyin.
Tamam'a tıklayın. İleri ve bitir'e tıklayın. Yazılım kalibre edildikten sonra bir solucan görüntüsü açın.
Ardından ölçüm (measure) menüsü altından kalibrasyonu (calibration) seçin ve ardından mekansal seçimi (select spatial) tıklayın. Açılır menüden mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Sonra, açılan penceredeki ölçüm (measure) menüsü altından ölçümleri (measurements) seçin.
Serbest çizim aracını seçin ve bilgisayar faresini kullanarak hayvan vücudunun merkezinden başından kuyruğuna kadar bir hat çizin. Uzunluk pencerede rapor edilecektir. Bu işlemi alandaki tüm hayvanlar için tekrarlayın.
Uzunluk ölçümlerini bir Microsoft Excel dosyasına veya uygun başka bir istatistiksel yazılıma aktarın. Her örnek için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Ardından, her grup için sonuçları student T-testi kullanarak karşılaştırın.
TGF beta süperailesi protein DBL-1, TGF beta yolağının aktivasyonu için gereklidir. Sinyal aktivasyonuna yanıt olarak, hücre içi smad sinyal ileticileri çekirdeğe taşınır ve gen transkripsiyonunu başlatır. TGF beta yolağının bozulduğu durumlarda, yabanıl tip hayvanlara göre daha kısa vücut uzunluğu da dahil olmak üzere daha küçük bir vücut boyutuna sahip oldukları görülür.
Böylece C. elegans için taramalar yapılır. Vücut boyutu mutantları, besleme yoluyla RNAi etkinliğini test ederek TGF-beta sinyalizasyon bileşenlerini ve modifikasyonlarını belirleyebilir. RNAi, dört farklı C. elegans suşunda DBL-1 yolak bileşenleri olan SMA-3 ve SMA-6'yı susturmak için kullanılmıştır.
Test edilen C. elegans suşları arasında RN AI hipersensitif olan iki suş (A one, Lin 15 B ve RF three) ile standart vahşi tip suş N two ve RNAi duyarlılığı burada gösterildiği üzere N two ile benzer olan LIN 36 suşu yer almıştır. SMA three veya SMA six ekspresyonu bozulduğunda, Lin 36'daki SMA six RNAi hariç, hayvanlar kontrol hayvanlarına göre anlamlı derecede daha kısa vücut boyutu sergilemiştir. RF three'deki arka plan.
RNAi işlemi sonrası genç yetişkinlerin arka gövde uzunlukları, yalnızca vektör uygulananların %84 ile %95'i arasındaydı. A one Lin 15 B arka planında, RNAi sonrası genç yetişkinlerin gövde uzunlukları kontrol hayvanlarının %68 ile %86'sı arasındaydı. Ancak, A one lin 15 B suşu az sayıda döl üretmektedir.
Bu durum, onları geniş ölçekli taramalar için uygunsuz hale getirir. Bu nedenle, bu teknikler için RF üç suyunun kullanımı önerilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, RNI interferans tekniğini kullanarak büyümeyi ve vücut boyutunu düzenleyen genlerin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu video, C. elegans'ta büyüme ve vücut büyüklüğünü düzenleyen genleri tanımlamak için RNA interferens (RNAi) kullanma prosedürünü gösterir. Bu yöntem, DBL-1/TGF-β sinyalizasyonu yoluyla vücut büyüklüğü düzenlemesinde yer alan genetik bileşenleri ortaya çıkarmak için geniş ölçekli taramayı sağlar.
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.