DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen özelliğe sahip partiküllerin seçilebileceği, yüksek çeşitlilikte bir sentetik adeno ilişkili viral kapsid kütüphanesi oluşturmaktır. Bu işlem; önce, daha sonra iki PCR reaksiyonu aracılığıyla kimerik diziler halinde yeniden birleştirilmelerini sağlamak amacıyla, kontrolle gerçekleştirilen DNAse I sindirimi ile aav kapsid genlerinin fragmanlara ayrılması, klonlanması ve seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, elde edilen PCR ürünü, en az 1 milyon farklı aav kapsid geni içeren bir plazmit kütüphanesi oluşturmak için replikasyon yeteneğine sahip bir aav konstrüktüne geri klonlanır.

Ardından, hedef hücrelerde veya hayvanlarda seçilebilen kimerik bir virüs kütüphanesi üretmek amacıyla, bu plazmit kütüphanesi bir adenoviral yardımcı plazmit ile birlikte 2 9 3 T hücrelerine transfekte edilir. Sonuçlar, kültürlenmiş hücrelerde veya yetişkin farelerde artırılmış veya daha spesifik reporter gen ekspresyonuna dayalı yeni sentetik A A V vektörlerinin başarılı moleküler mühendisliğini ve evrimini göstermektedir. Bu tekniğin peptid display gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, DNA family shuffling yönteminin; hücre bağlanması ve hücre içi taşınmadan, uncoating ve çekirdekteki gen ekspresyonuna kadar AAV kapsidinin birden fazla özelliğini aynı anda değiştirme ve geliştirme potansiyeline sahip olmasıdır.

Bu yöntem, belirli bir terapötik uygulama için nasıl ideal bir vektör elde edileceği veya viral kapsidin belirli bir özellikten sorumlu olan bölgelerinin nasıl analiz edileceği gibi, gen tedavisi ve viroloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntemimiz, HIV için T-hücreleri veya hepatit virüsleri için hepatositler gibi viral hedef hücreleri spesifik ve güçlü bir şekilde enfekte eden AV vektörlerinin moleküler evrimine olanak tanıdığı için, bu tekniğin etkileri viral patojenlerle enfeksiyonlar da dahil olmak üzere birçok insan hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem AV biyolojisine dair içgörü sağlayabilir ve gen tedavisi için AV vektörlerini geliştirmek amacıyla kullanılabilir.

Bu yöntem, doz kodlayan floresans, üç raporlayıcı, hücresel enzimler veya RNA interferansı ile ilişkili proteinler gibi temel veya uygulamalı öneme sahip diğer gen ailelerine de kolayca uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikri, yetişkin fare dilimlerine terapötik genler nakletmek için uygun bir vektör aramaya çalışırken edindik ve doğal olarak oluşan tüm AV serotiplerinin, insan popülasyonunda yüksek yaygınlık ve buna bağlı olarak yüksek immünite kullanımı insidansı veya kültür hepatositlerinin in vitro etkin transdüksiyonuna rağmen in vivo düşük performans gibi dezavantajlara sahip olduğunu fark ettik. DNA tabanlı AV kapsid gen fragmantasyonu ve viral kütüphane üretim basamaklarının bazıları, deneyim ve kritik aşamalara dair farkındalık gerektirdiği için öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel sunumu kritik öneme sahiptir. Bu sayede, çeşitli adeno ilişkili viral kapsid genlerinin yeterli miktarlarda rutin hazırlığı kolaylaştırılacaktır.

DNA karıştırma (shuffling) işlemi için bu genler başlangıçta ortak bir plazmit omurgasına alt klonlanır. Bunu gerçekleştirmek için, istenen cap genleri önce cap F ve cap R primerleri kullanılarak yaygın olarak bulunan AAV plazmitlerinden PCR ile amplifiye edilir. Ardından cap genleri, spesifik primer bağlanma bölgelerinin yanı sıra restriksiyon bölgeleri içerecek şekilde tasarlanmış bir plazmite klonlanır. Bu örnekte, cap geni; cap amplifikasyonu için kullanılan primerlerde ve alıcı plazmitle mevcut olan, ancak çoğu AAV'de bulunmayan PAC1 ve ASC1 bölgelerine klonlanır. AAV kapsid genlerini kodlayan plazmit setleri oluşturulduktan sonra, seçilen cap genleri T3 ve T7 primerleri kullanılarak amplifiye edilerek PCR ile cap karıştırma prosedürüne başlanır.

200 nanogram cap plazmidi, her biri iki mikromolar nihai konsantrasyonda olan primerler, 10 mikrolitre beş x high five tamponu ve bir mikrolitre high five polimeraz içeren 50 mikrolitre PCR reaksiyonu hazırlayın. Bu reaksiyon, kütüphaneye dahil edilecek cap genlerinin sayısına bağlı olarak altı adet karıştırma reaksiyonuna kadar yeterli olacak yaklaşık üç mikrogram PCR ürünü sağlayacaktır. 95 degrees Celsius'de beş dakika ile başlayın ve ardından 94 degrees Celsius'de 15 saniye, 57 degrees Celsius'de 30 saniye ve 68 degrees Celsius'de üç dakikadan oluşan 40 döngü gerçekleştirin; son olarak 72 degrees Celsius'de 10 dakikalık bir final adımı uygulayın.

PCR ürünleri saflaştırıldıktan sonra, Kyra'ya yeniden birleştirilmek üzere cap geni fragmanları oluşturmak için kontrollü bir DNA sindirimi uygulanır. Bu prosedürün en zor yanlarından biri, Kyra'lara yeniden birleştirme işlemi için uygun bir aralıkta DNA sindirilmiş cap DNA fragmanları elde etmektir; bu amaçla, başlangıçta saflaştırılmış cap genlerinin PLE miktarlarını hazırlar ve ardından değişen koşullar altında çok sayıda paralel reaksiyon kurarız. Sindirimi eşit şekilde gerçekleştirmek için, çeşitli cap PCR ürünlerini 54 µL su içerisinde toplam dört µg olacak şekilde karıştırın; ardından reaksiyona dikkatlice 6 µL DS reaksiyon tamponu ve 0,5 µL DNAse I ekleyin. Tüpü üç kez hafifçe santrifüjleyin ve hemen 25 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirin.

Bu ilk reaksiyonu bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, ikinci bir sindirim reaksiyonu hazırlayın, ancak bunu 25 °C'de bir dakika 15 saniye boyunca inkübe edin. Bu şekilde, inkübasyon süresini 15 saniyelik artışlarla değiştirerek, bir ile iki dakika arasında inkübasyon sürelerine sahip birden fazla paralel reaksiyon kurun.

Her bir reaksiyonu altı µL 25 mM EDTA ekleyerek durdurun. Tüpü kısa bir süre vorteksleyin ve 75 °C'de 10 dakika inkübe edin. Çoklu paralel reaksiyonlar sonucunda, farklı inkübasyon sürelerini temsil eden beş adet DNA ile digere edilmiş kap örneği elde edilecektir; kap fragmanlarını standart %1'lik AGOZ jel üzerinde saflaştırın.

İdeal olarak, başlangıç için bir dakika, 45 saniye veya iki dakikalık inkübasyon süreleri ile bu örnekte gösterildiği gibi, 100 ile 500 baz çifti arasında bir yayılma (smear) görülmelidir. DNA family shuffling işleminde kap fragmanları, önce kısmi homolojilere dayanarak kendi kendilerini primerledikleri bir PCR aracılığıyla tam uzunluktaki dizilere yeniden birleştirilir. 500 nanogram saflaştırılmış fragman, 10 mikrolitre 10 x füzyon tamponu, bir mikrolitre 10 milimolar dNTPs, 1,5 mikrolitre DMSO ve 0,5 mikrolitre füzyon polimeraz içeren 50 mikrolitrelik bir reaksiyon hazırlayın.

İki polimeraz 98 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edilir ve ardından 98 °C'de 10 saniye, 42 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 45 saniyeden oluşan 40 döngü uygulanır; bunu 72 °C'de 10 dakikalık son bir adım takip eder. Daha sonra, korunmuş yan dizilere bağlanan primerler kullanılarak ikinci bir PCR ile sonraki klonlama için yeniden birleştirilmiş kap genleri amplifiye edilir. Örneğin, SAF ve SAR veya CUF ve CUR setleri; her biri 2 µM nihai konsantrasyonda olan ilk PCR primerlerinden ikişer microlitre, 0,5 µL magnezyum klorür, 10 µL 5x high-FI tamponu ve 1 µL high-FI polimeraz içeren 50 µL'lik bir reaksiyonla kurulur.

Sonraki klonlama işlemleri için yeterince yüksek verim sağlamak amacıyla 16 ila 24 PCR önerilir. PCR'lar havuzlandıktan ve tam uzunluktaki kap bandı saflaştırıldıktan sonraki adım, saflaştırılmış kap gen havuzunu, replikasyon yeteneğine sahip bir AAV plazmidine klonlamak için PacI ve ScaI ile sindirmektir. Alıcı plazmid, AAV P5 promotörü kontrolündeki AAV2 rep genini çevreleyen AAV ters uç tekrarlarını, PacI ve ScaI bölgelerini taşımaktadır.

rep'in aşağısındaki restriksiyon bölgeleri, karıştırılmış cap havuzunun çerçeve içi (in-frame) klonlanmasına olanak tanır. Oklarla belirtilen LSE primer bağlanma bölgeleri, cap geni sekanslaması için kullanışlıdır; cap fragmanlarını ve uygun şekilde kesilmiş alıcı plazmit iskeletini üçte bir molar oranda karıştırın. Mikrolitre başına 15 nanogram final DNA konsantrasyonu ile 20 transformasyon için yeterli, toplam 40 mikrolitre hacminde bir master mix hazırlayın.

16 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün ligasyon reaksiyonunu e coli'ye transforme edin. İki µL ligasyon reaksiyonunu 30 µL elektro-kompetan e coli ile karıştırın ve önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetlerine aktarın; buz üzerinde 1,8 kV, 200 Ω ve 25 µF değerlerinde elektroporasyon yapın. Zaman sabiti beş ms civarında olmalıdır; hemen ardından 1 mL önceden ısıtılmış SOC besiyeri ekleyin ve 250 mL'lik bir erlene aktarın.

Bu şekilde gerçekleştirilen 20 elektroporasyon, yaklaşık 1 × 10⁶ farklı klon çeşitliliğine sahip bir kütüphane sağlayacaktır. Havuzlanmış transformasyonlara bir hacim önceden ısıtılmış SOC besiyeri ekleyin ve 37 °C'de ve 180 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın. Ardından, havuzlanmış transformasyonlardan 40 mL'yi, ampisilin içeren 800 mL LB besiyerine ekleyin ve aynı koşullar altında 16 saat daha inkübe edin; daha sonra kütüphane plazmit DNA'sı ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak saflaştırılır.

Viral kütüphanesinin üretimi, HEC 2 9 3 T hücrelerinin a a v kütüphanesi ile transfeksiyonu ile başlar; bu prosedüre başlamak için, 10 adet 15 santimetrekarelik kapta HEC 2 9 3 T hücrelerini ekini yapın ve 37 °C'de 48 saat boyunca büyütün. Her transfeksiyon için, iki ayrı tüpte aşağıdaki iki reaktif karışımını hazırlayın. İlk tüpteki miktarlar 10 plaka için verilmiştir.

7,9 mililitre sodyum klorür ve DNA'yı karıştırın ve toplam hacim 15,8 mililitre olacak şekilde su ekleyin. İkinci tüpe 3,52 mililitre polietilen amin, 7,9 mililitre sodyum klorür ve 4,38 mililitre su ekleyin. Karışımları birleştirin, vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından solüsyonu 2 9 3 T hücrelerinin bulunduğu her bir kaba eşit şekilde dağıtın. 37 °C'de inkübe edin.

48 saat sonra viral kütüphane hasat edilebilir. Hücreleri ortamın içine sıyırarak toplayın, tüm kaplardaki hücreleri tek bir tüpte birleştirin ve 1200 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini altı mililitre lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin ve ardından beş dondurma-çözme döngüsüne tabi tutun; beş dondurma-çözme döngüsünden sonra, 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca Ben Nase ile inkübe edin.

Ardından, hücre kalıntılarını 3.750 RPM'de 20 dakika boyunca çöktürün. Bir pastör pipeti kullanarak bir Beckman Quicks seal santrifüj tüpüne beş mililitre virüs süspansiyonu, ardından 1,5'er mililitre %15, %25 ve %40'lık idal solüsyonu ekleyerek saflaştırma için bir gradyan oluşturun. Gradyanın üzerini lizis tamponu ile tamamlayın ve 4 °C'de iki saat boyunca 50.000 K'de ultrasantrifüj edin.

Ultrasantrifüj işlemi tamamlandığında tüpü rotordan çıkarın ve tüpün dış kısmını %70 etanol ile temizleyin. Havalandırma için tüpün üst kısmına bir iğne saplayın ve %40 IOL fraksiyonundan 1,2 mililitre çekmek için başka bir iğne kullanın. Boş yapılar içerdiği için %25'lik fraksiyondan çekim yapmamaya özen gösterin.

Aav kapsidleri. Orijinal plazmit kütüphanesinden alınan bireysel klonlar, bir raporlayıcı gen eksprese eden rekombinant Aav vektörleri üretmek üzere kullanılarak fonksiyonellikleri ve çeşitlilikleri açısından analiz edilir. Kültür hücreleri veya hayvanlar daha sonra saflaştırılmış virüsün farklı miktarlarıyla enfekte edilir ve transdüksiyon verimliliği belirlenir.

Burada, karıştırılmış kap genleri ile oluşturulmuş beş farklı rekombinant YFP eksprese eden AAV vektörü ile enfekte edilmiş üç insan hücre hattından elde edilen floresans mikroskopi sonuçları gösterilmektedir. Transdüksiyon verimliliğini analiz etmek için alternatif bir yöntem, floresan raporlayıcı gen ekspresyonunun FACS tabanlı ölçümüdür. Bu şekil; orijinal bir kütüphaneden rastgele seçilmiş, karıştırılmış kap genleri ile oluşturulmuş 18 farklı rekombinant YFP eksprese eden AAV vektörü ile enfekte edilmiş dört hücre tipinden (insan böbrek, insan serviks, fare fibroblastları ve insan T hücresi) elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir.

YFP ekspresyonu, kolaylaştırmak amacıyla renklerle kodlanmıştır. Görselleştirilen değerler, transduksiyon gerçekleşmiş hücrelerin yüzdelerini temsil etmektedir; burada siyah %0'ı, beyaz ise her bir hücre tipi klonu için ölçülen en yüksek değeri ifade eder. Klon B2'deki kırmızı renk, seçilmemiş kapsidlerden beklendiği üzere genel etkinliği düşük olan bir klonu örneklendirmektedir. Viral kütüphane daha sonra, belirli bir hücre hattında veya hayvanlarda seçilim için, istenen özelliklerin çoğunu veya tamamını sergileyen tekil partiküller açısından taranabilir.

Kültür hücrelerinde, hücreler önce v büyümesini desteklemek için kütüphanenin çeşitli alikotları ve ENO virüsü beşi ile birlikte enfekte edilir, ardından hücreler hasat edilir ve amplifiye edilmiş a a v ekstre edilip yeni hücreleri yeniden enfekte etmek için kullanılır. Hücrelerin ko-enfeksiyonu için optimal a a v adenovirus oranlarının belirlenmesi önemlidir ve etkili arius enfeksiyonu için iyi bir ölçüt, virüs inokülasyonundan üç gün sonra hücrelerin yuvarlaklaşması ve ayrılmasıyla kanıtlanan sitopatik etkilerin görülmesidir; bu şekildeki sol üst panel enfekte edilmemiş hücreleri gösterirken, diğer paneller hücre başına belirtilen partikül miktarlarındaki adenovirüs ile enfekte edilmiş hücreleri göstermektedir. a a v enfeksiyonu ve amplifikasyonu için bir başka yararlı okuma yöntemi, yüksek düzeyde korunan bir a a v kapsid epitopunu tanıyan B bir antikoru kullanılarak western blotting ile kapsid proteinlerinin tespit edilmesidir.

Sol blot, çeşitli mikrolitre hacimlerdeki bir a a V kütüphanesi ve yardımcı ENO virüsü ile ko-enfekte edilmiş hücreleri göstermektedir. İlk iki şerit, ancak fark edilebilen a a v protein ekspresyonu sağlayan koşullar için iyi örneklerdir; bu durum, yeterli ancak aşırı olmayan bir a a v enfeksiyonu ve amplifikasyonunu, dolayısıyla istenen sık genotip-fenotip bağlantısını göstermektedir. Bu nedenle, taze hücrelerin yeniden enfekte edilmesi için bu süpernatantların 0.11 veya 10 mikrolitresi kullanılmıştır.

Western blot sonuçları sağdaki hücrelerde gösterilmiştir. LA c'de, negatif kontrol olarak yalnızca a v ile enfeksiyon uygulanmıştır. Ayrıca, tekrarlanan enfeksiyon turları sırasında kütüphane çeşitliliğinin DNA dizileme yoluyla izlenmesi kritik önem taşır.

Bu diyagram, AAV2, AAV8 ve AAV9 tabanlı bir kütüphaneden elde edilen AAV klonlarının protein dizilerinin seçim öncesi ve sonrası karşılaştırmalarını göstermektedir; kırmızı çizginin üzerindeki diziler ebeveyn AAV'leri göstermektedir. Mor oklar, homolog rekombinasyon olaylarını belirtmektedir. Kırmızı ok, seçilen tüm klonlarda gözlemlenen AAV2 ve AAV9 arasındaki bir çapraz geçişi (crossover) işaret etmektedir. Hayvanlarda seçim için, AAV kütüphanesi hayvanlara infüze edilir, hedef hücrelerden veya dokudan PCR ile geri kazanılır ve ardından yeni bir enfeksiyon döngüsü için yeniden klonlanır ve paketlenir.

Burada, periferik kütüphane infüzyonundan bir hafta sonra fare karaciğerlerinden başarıyla enfekte edilmiş av klonlarının kurtarılmasına dair bir örnek gösterilmektedir. Birinci şerit beklenen 2.2 kilobaz bandını gösterirken, ikinci şerit şablon içermeyen kontroldür; M şeridindeki DNA marker bantlarının boyutları kilobaz cinsinden belirtilmiştir. Seçim prosedüründen bağımsız olarak, zenginleştirilen kapsid varyantları nihayetinde uygun sistemlerde doğrulanmalıdır.

Zenginleştirilmiş bir AAV kymera'sının kültür hücrelerindeki üstün performansına bir örnek burada gösterilmiştir. Daha koyu renkler, partikül sayısı başına, dolayısıyla klon başına daha yüksek enfeksiyözlüğü belirtir. AAV-DJ, geniş bir hücre hattı yelpazesinde sekiz doğal AAV yabani tip koleksiyonundan daha yüksek performans göstermektedir.

Son olarak, fare karaciğerindeki seçilmiş bir AAV KYMERA klonunun analizi gösterilmektedir. Mirroring hepatoma hücreleri üzerinde seçilen bir AAV DN, lusiferaz eksprese eden rekombinant vektörler üretmek için kullanılmıştır; temsilci farelerimiz (grup başına üç adet), bu vektörün veya fare karaciğerinde bilinen en güçlü doğal izolatlardan biri olan vahşi tip AAV8 tabanlı bir kontrolün eşit dozlarda periferik infüzyonundan bir hafta sonra gösterilmiştir. AAV DN klonunun karaciğerde genel ekspresyonu biraz daha düşük olsa da, görüntüleme yazılımı aracılığıyla karaciğer ekspresyon seviyeleri ayarlandığında, hepatik olmayan dokularda önemli ölçüde daha az hedef dışı etki göstermesi nedeniyle bu organ için daha spesifik olduğu dikkat çekmektedir.

Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında, a a V kapsid genlerinin amplifikasyonu ile başlayıp viral kütüphane ile sona eren bir haftalık bir süreçte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, burada sunulan protokolün doğal AV serotiplerinin seçimine ilişkin deneyimlerimizden türetildiği ve diğer kullanıcılar kendi özel kütüphanelerini oluştururken bazı koşulların uyarlanması ve ince ayarlarının yapılması gerekebileceği unutulmamalıdır. Bu prosedürün yanı sıra, oldukça çeşitli kütüphaneler oluşturmak veya DNA ailesi karıştırma yöntemiyle oluşturulmuş ve zenginleştirilmiş kapsidlerin özelliklerini daha da geliştirmek amacıyla, AGENESIS ile bölgeye özgü peptid sergileme veya PCR tabanlı rastgeleleştirme gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu teknik, viral gen iletimi alanındaki araştırmacıların, HIV enfeksiyonu ve T hücreleri gibi geleneksel AAV tiplerinin yetersiz sonuçlar verdiği hastalıklar ve ilgili hedef hücreler için terapötik stratejiler keşfetmelerinin yanı sıra, insan kök hücrelerine ve kültürdeki diğer zor enfekte olan hücrelere vektör tabanlı gen transferini araştırmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, gen fragmantasyonu ve yeniden birleştirme kombinasyonunu kullanarak yüksek çeşitlilikte sentetik adeno ilişkili viral vektör kütüphanelerinin nasıl mühendislik yöntemleriyle oluşturulacağı ve evriltileceği ile gen transfer vektörleri olarak kullanılmak üzere bireysel kapsidleri istenen spesifik özelliklerle zenginleştirmek amacıyla bu kütüphanelerin kültür hücrelerinde veya hayvanlarda temel olarak nasıl seçileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Adenovirüslerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken birçok önlem alınması gerektiğini unutmayın.