Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanopartiküllerin ve bakterilerin hücre içi alma mekanizmalarını multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile analiz etmek için. Makrofajlar, aktin polimerizasyonunu inhibe etmek amacıyla önce cyto klain D ile ön işlemden geçirilir. Nanopartiküller veya salmonella, makrofaj monotabakasına eklenir ve inkübe edilir.

Ardından makrofajlar hasat edilir, fikse edilir ve bir görüntü akışı kullanılarak analiz için işaretlenir. Multispektral görüntüleme akış sitometresi, nanopartikülleri ve/veya salmonella'yı internalize etmiş hücreleri, yüzeyine nanopartiküller ve/veya salmonella bağlanmış olanlardan ayırt eder. Elde edilen veriler, hem salmonella'nın hem de nanopartiküllerin yalnızca cyto klain ile işlem görmemiş hücreler tarafından internalize edildiğini göstermektedir.

D, internalizasyonun aktin bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, floresan sinyal yoğunluklarının ve farklı hücresel özellikler arasındaki uzamsal çözünürlüğün yüksek hızda doğru bir ölçümünü sağlar.

Bu yöntem, hem biyomalzeme aşı ve ilaç iletimi araştırmaları hem de konakçı-patojen etkileşimi çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu, polianhidrit nanopartiküller ve bakteriler tarafından kullanılan internalizasyon yollarının belirlenmesini içerir. Genel olarak, bu yöntemi yeni kullanan kişiler genellikle başlangıçta zorluk yaşarlar.

Optimal floresans sinyallerini elde etmek için boyaların titrasyonuna zaman ayırmak önemlidir. Ayrıca, yazılımı tanımak ve analiz şablonları oluşturmak da zaman almaktadır. Mikroskopi ve diğer teknikleri kullanırken poli hidro nanopartiküllerin patojen benzeri özellikler sergilediğini fark ettiğimizde, bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz oluşmuştu.

Ardından, analiz gerçekleştirmeden önce Salmonella ve polen hidrit nanopartikülleri tarafından kullanılan internalizasyon süreçlerini karşılaştırmak için yüksek kapasiteli bir sistem istedik. Tüm memeli ve bakteriyel hücre kültürleri hasat edilmeli ve nanopartikül süspansiyonları hazırlanmalıdır. Konflüen RA W2 64.7 hücrelerini bir hücre kazıyıcı kullanarak hasat ederek başlayın.

Hemo-sitometre kullanarak hücre sayısını belirleyin. Ardından hücreleri, 24 kuyucuklu bir kültür kabına, kuyucuk başına 0,5 mL Complete DMEM içerisinde 5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin. 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.

Salmonella tarica hazırlamak için, 16 by 125 mm'lik otoklavlanmış vidalı kapaklı cam kültür tüpü içerisindeki RA W2 64.7 hücreleri için yüzlük bir enfeksiyon multiplicitiesi elde etmek amacıyla salmonellayı C-D-M-E-M içerisinde dilüe edin. Ardından, steril peyzah paper kullanarak, rean ve meslektaşlarının 2009 tarihli Pharmaceutical Research yayınında tanımlandığı şekilde üretilen %1 FITC yüklü polianhidrit nanopartiküllerden 5 mg'ı 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne tartarak ekleyin. Nanopartikülleri 0,5 ml soğuk fosfat tamponlu saline ekleyin ve buz üzerine yerleştirin.

Tüpü buz üzerinde tutun. Süspansiyonu yaklaşık 25 saniye boyunca, dört ila altı jul seviyesinde sonike etmek için mikro uçlu bir ultrasonik sıvı işlemci kullanın. Gerekli tüm hücreler ve reaktifler hazırlandığına göre, fagositoz deneyi gerçekleştirilebilir.

İlk plaka üzerindeki analiz hazırlığı için kültürlenmiş RA W2 64.7 hücrelerini içeren 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarını etiketleyin. Aşağıdaki örneklerin her biri üç paralel şeklinde analiz edilecektir: cyto ve D ile nanopartiküller, cyto ve D ile salmonella, nanopartiküllü besiyeri, sadece nanopartiküllü besiyeri, sadece salmonella ve sadece AF 60 boyalı hücreler. 4 °C kontrolleri ikinci plakada analiz edilecek olup, besiyeri artı nanopartiküller ve besiyeri artı salmonella örneklerini içerecektir. Bu düşük sıcaklıktaki inkübasyon, fagositoz gibi yavaş hücresel süreçleri engeller. İndüksiyondan bir saat önce, uygun kuyucuklara 5 µg/mL cyto ve D ile C-D-M-E-M ekleyin ve hücreleri 37 °C'de inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, nanoparçacık süspansiyonunu vorteksleyin ve uygun kuyucuklara 10 µL ekleyin. Ardından salmonella'yı vorteksleyin ve 100 MOI oranında uygun kuyucuklara ekleyin. Karıştırmak için plakaya birkaç kez hafifçe vurun.

Ardından örnek plaklarını 37 °C'de ve negatif kontrol plaklarını 4 °C'de 45 dakika boyunca bekletin. İnkübasyonun ardından plakları buz üzerine yerleştirin; bağlanmamış partikülleri, salmonella'yı ve ölü veya kopmuş hücreleri uzaklaştırmak için eski besiyerini aspire edip atarak hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Petal magnezyum kullanımı.

Bu aşamada ön PBS uygulaması, hücrelerin substrattan ayrılmasını kolaylaştırdığı için gereklidir. Hücreleri toplamak için 250 µL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve kuyucukları nazikçe kazıyın; toplanan hücreleri silikonize snap kapaklı mikro santrifüj tüplerine pipetleyin ve buz üzerinde tutun. Bir mililitre soğuk yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 250 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, ters çevrilmiş mikro santrifüj tüpünü kağıda vurarak kalıntı tamponu uzaklaştırın.

Mikrosantrifüj tüpünü bir test tüpü rafı üzerinde nazikçe sürterek hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri sabitlemek için 100 microliters %4'lük PBS içinde paraformaldehit ekleyin ve hücreleri 15 dakika boyunca bekletin. Oda sıcaklığında, bir milliliter perm yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve ardından dört degrees Celsius'de 10 dakika boyunca 250 times G hızında santrifüjleyin.

Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, kalıntı tamponu daha önce olduğu gibi giderin. Ardından RA W2 64.7 hücrelerini boyamak için; aktin için, Alexa Fluora foid içeren 100 µL perm yıkama tamponunu altı adet 60'lık tüpe 15 dakika boyunca ekleyin.

Oda sıcaklığında, boyanmamış örnekler phin içermeyen perm yıkama tamponu ile inkübe edilmelidir. Boyama işleminden sonra, hücreleri tekrar yıkayıp santrifüjleyin, ardından %1 PFA içeren 50 µL PBS içinde yeniden süspanse edin ve veri toplama işlemine kadar 4 °C'de karanlıkta saklayın. Gücü açın, görüntü akışını başlatın ve programı çalıştırın.

Dosya menüsünden akışkanlar sistemini ilhamlandırın (inspire) ve başlatın. Varsayılan şablonu yükle (load default template) seçeneğini belirleyin. Görüntü galerisi görünüm menüsünde, tümünü seçin ve gerekiyorsa boncukların görüntülenmesine başlamak için kurulumu çalıştır (run setup) düğmesine basın; görüntüleri yatay olarak merkezlemek için çekirdek takibini (core tracking) ayarlayın.

Brightfield kanalını seçin ve yoğunluğu ayarla (set intensity) seçeneğine tıklayın. Akış hızı varyasyon katsayısı tutarlı bir şekilde 0,2% değerinin altına düşene kadar bekleyin. Yardım (assist) sekmesinde, kalibrasyonları ve testleri çalıştırmak için tümünü başlat (start all) seçeneğine tıklayın ve yazılımda tümünün geçtiğini doğrulayın. Örnek yükle (load sample) seçeneğine tıklayın.

Ardından, talimat verildiğinde, en parlak örneği içeren flakonu yerleştirin. Tüm florokromlar örnek yükleyiciye yerleştirilmişken, 40 x büyütmeyi seçin. Cihaz ayarları belirlendikten sonra, tüm deney boyunca bu ayarları değiştirmeyin.

Yazılımdaki lazer simgelerine tıklayarak deneydeki her bir lazeri açın ve her bir florokromun, saçılım grafiklerinde (scatterplots) ölçüldüğü üzere maksimum piksel değerlerini 104.000 sayım olacak şekilde lazer gücünü ayarlayın. İstenmeyen nesnelerin toplanmasını önlemek için yazılımdaki hücre sınıflandırıcı (cell classifier) penceresine tıklayın. Ardından, yalnızca hücre verilerini toplamak için, aydınlık alan (brightfield) için alan alt sınır kanal birini seçin ve değeri 50 µm olarak ayarlayın; alanı 50 µm'den küçük olan nesneler döküntü olarak değerlendirilecek ve veri toplama işlemine dahil edilmeyecektir.

Yazılımdaki ilgili kanal simgelerine tıklayarak toplanacak kanalları seçin. Kurulum (setup) sekmesi altında 1, 2, 3, 4, 5 ve altı numaralı kanallar seçilmiştir. Dosya numarasını ve hedef klasörü girin.

Sıra numarasını bir ve toplanacak olay sayısını 5,000 olarak ayarlayın. İlk deney veri dosyasını toplamak ve kaydetmek için run, acquire seçeneğine tıklayın. FLL'ye tıklayın ve bir sonraki deneysel örneği çalıştırın.

Tüm deneysel örnekler toplanana kadar işlemi tekrarlayın. Ardından, kontrolleri çalıştırmak için comp settings seçeneğine tıklayın. Bu işlem, bright field ve scatter lazerlerini kapatacak ve acquire sekmesi altında tüm floresan kanallarının toplanmasını sağlayacaktır.

Giriş değerini 500 olarak değiştirin. Ardından kontrol tüpünü yerleştirin ve çalıştır'a tıklayın. Tekli boyanmış kontrollerde 500 pozitif hücre toplamak için veri toplama işlemini gerçekleştirin.

Bir kompanzasyon matrisi oluşturmak için deneydeki her bir florokrom için işlemi tekrarlayın. Tüm örnek görüntüleri elde edildikten sonra, masaüstündeki ideas simgesine çift tıklayarak analiz için ayrılmış farklı bir bilgisayarda ideas analiz yazılımını başlatın. Internalization sihirbazına çift tıklayın ve test örnek RIF dosyalarından birini yükleyin.

Bir açılır pencere, test dosyalarının yüklenmesi için talimatlar sağlayacaktır. Talimatları izleyin ve sonraki düğmesine tıklayın. Ardından, yeni matris seçeneğine tıklayın.

Bu işlem kompanzasyon sihirbazını başlatacaktır. İstendiğinde, eklemek için tek renk kontrollerine ait veri dosyalarını seçin. Kompanzasyon matrisi dosyası kaydedilene ve internalizasyon sihirbazının ikinci adımındaki kutuya yüklenene kadar, talimatları izleyerek sihirbazda "ileri" butonuna tıklayın.

İleri'ye tıklayın ve bir DAF dosyası oluşturulana kadar talimatları izleyin. Görüntüleme sırasında kullanılan görüntü kanallarını seçerek görüntü görüntüleme özelliklerini ayarlayın. FITC için ikinci kanala, AF 647 için beşinci kanala tıklayın.

Varsayılan olarak parlak alan ve yan saçılım seçilidir. Hücre sınırını belirlemek için parlak alan kanalı O'yu ve tek hücre popülasyonunu tanımlamak için nanoparçacıkların veya bakterilerin toplandığı kanal O2'yi seçin; tüm hücrelerin parlak alan alanı ile parlak alan en-boy oranının saçılım grafiği oluşturulur. Birden çok veri dosyasının yüksek verimli analizi bir şablon dosyası gerektirir, bu nedenle şablon dosyası oluşturulurken kapıların (gate) dikkatle tanımlanması kritik önem taşır.

Her bir nokta, tek bir hücre görüntüsüne ait değerleri temsil eder. Bir grafikteki tek bir noktaya tıklayarak, görüntü galerisindeki o hücreye ait görüntüyü seçebilirsiniz.

Ardından, tek hücreli olaylara karşılık gelen alan ve en-boy oranına sahip hücrelerin etrafına bir kapı (gate) çizin. Tek hücrelerin en-boy oranı yaklaşık bir iken, dubletlerin en-boy oranı yaklaşık 0,5'tir.

Tek hücreleri içeren bölgeyi, dubletlerden veya döküntülerden ayırt etmek için birden fazla hücreye tıklayın. Brightfield görüntüsünün brightfield gradyanı kareler ortalamasının kök değerine ait bir histogram oluşturmak için sonraki butonuna tıklayın.

Ardından popülasyon sekmesi altında, seçilen bin'i görüntülemek için bin seçeneğini seçin. Hücrelerin nerede olduğunu ve en iyi odağı belirlemek için bin'lere tıklayın. Odaklanmış hücreleri gait etmek için bir çizgi bölgesi çizmeye başlayın.

Gradyan RMS ne kadar yüksekse odaklama o kadar iyidir; kapılan başka boyalar yoksa sonraki adımı atlayın. X ekseninde kanal iki yoğunluğuna, Y ekseninde ise kanal ikinin maksimum pikseline karşı yeni bir dağılım grafiği oluşturulur. Nanopartiküller veya bakteriler için pozitif olan hücrelerin etrafına çizilecek bölgeyi belirlemeye yardımcı olması için noktalara tıklayın ve görüntüleri inceleyin.

İçselleştirme özelliğinin bir histogramı, sıfırdan başlayan bir bölge ile oluşturulur ve bu bölge görüntüler gözlemlenerek ayarlanmalıdır. İçselleştirme özelliği, hücre içindeki yoğunluğun tüm hücrenin yoğunluğuna oranıdır. Sıfır değerinde yoğunluğun yarısının içeride olacağı şekilde ölçeklendirilmiştir.

Sihirbaz, hücre yüzeyini bulmak için kullanılan hücre görüntüsü girişini kullanarak bir maske oluşturmuş ve bunu dört piksel aşındırarak her hücrenin iç kısmını belirleyen bir bölge yaratmıştır. Gerektiğinde, önce parlak alan görüntüsü üzerinde bir nesne maskesi oluşturup bunu daha fazla veya daha az piksel aşındırarak, farklı hücre tipleri için bu maskenin manuel olarak ayarlanabileceğini unutmayın. İnternalizasyon özelliği, yazılımdaki bir algoritma kullanılarak bu aşındırılmış nesne maskesi üzerinden hesaplanır.

Bu özellik, floresan sinyallerinin çoğunluğu maske sınırları içinde olan internalize olmuş partikül ve bakterileri, bu örnekte gösterildiği gibi floresan sinyallerinin çoğunluğu maske sınırlarının dışında kalan yüzeye bağlı partikül ve bakterilerden ayırt etmemizi sağlar; aşındırılmış nesne maskesine dayalı yeni bir internalizasyon özelliği ile yeni bir histogram oluşturun. Seçili bin modunda görüntüleri inceleyerek internalize olmuş hücreleri kapılamak (gate) için bir bölge çizin. Kapıyı 0.3 olarak ayarlayın.Burada.

0,3'ten düşük puan alan hücreler, yüzeye bağlı partikül pozitif hücreler olarak kabul edilir. Arkaplan etiketlemeli hücreleri elemek ve spesifik olarak internalize olmuş nanopartikülleri veya bakterileri tanımlamak için analiz menüsünden özellikleri seçin. Analiz menüsüne tıklayın.

Ardından, ortalama nokta sayısını istatistik raporuna eklemek için yanındaki nokta sayımı (spot count) özelliğine tıklayın. Raporlar menüsünde, raporlar simgesine tıklayın. Daha sonra istatistik raporunu tanımlayın, sütunları ekleyin ve uygun hücre popülasyonunu seçin.

Tamam'a tıklayın. İçselleştirme sihirbazı, veri dosyasını tüm deneysel dosyaların toplu analizi için kullanılacak bir şablon dosyası olarak kaydetmek amacıyla bu rapora otomatik olarak istatistikler ekleyecektir. Dosya menüsüne tıklayın ve şablon olarak kaydet seçeneğini belirleyin.

Şablon dosyaları. Idea yazılımında birden fazla veri dosyasını analiz etmek için .AST uzantısına sahip olun. Araçlar'a (tools) tıklayın, toplu veri dosyalarını (batch data files) seçin ve tüm RIF dosyalarını girin.

İşleme tabi tutulacak grubu göndermek için ilgili bölümlere kompanzasyon matrisi dosyasını ve şablon dosyasını ekleyin, ardından gönder düğmesine tıklayın. İşleme adımından sonra tüm RAF dosyaları analiz edilir ve her bir ham dosya için DAF dosyaları oluşturulur. Aktin inhibisyonunun ve düşük sıcaklığın salmonella ve nanopartiküllerin fagositozu üzerindeki etkisini karşılaştırmak amacıyla, tüm örneklerin istatistiklerini içeren nihai bir rapor oluşturulur.

RA W2 64.7 hücreleri, besiyerinde ya cyto chalasin D ile ya da cyto chalasin D olmadan 37 °C'de veya besiyerinde 4 °C'de inkübe edildi. Hem sıcaklık hem de aktin manipülasyonları, hem nanopartiküllerin hem de salmonella'nın içselleştirilmesini azalttı. Bununla birlikte, hücrelerin cyto chalasin D ile inkübe edilmesi, yüzeye bağlı salmonella içeren hücre yüzdesini azaltırken, yüzeye bağlı nanopartiküller içeren hücrelerin yüzdesini artırdı.

Yüzeye bağlı nanoparçacıklar açısından pozitif olan hücrelerin yüzdesi, 37 °C'de yaklaşık %8'den, cytochalasin D veya 4 °C işlemi sonrası %35'in üzerine çıkmaktadır. Buna karşılık, yüzeye bağlı Salmonella içeren hücrelerin yüzdesi, cytochalasin D işlemi sonrası %35'ten %15'e düşmüştür. RAW 264.7 hücrelerinin 4 °C'de Salmonella ile inkübe edilmesi, 37 °C kontrolü ile karşılaştırıldığında, yüzeye bağlı bakteri miktarında belirgin bir artış olmaksızın internalizasyonu azaltmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu veriler, Salmonella ve nanoparçacıkların, aktin gerektiren ve sıcaklığa bağımlı olan benzer bir hücresel süreçle internalize edildiğini göstermektedir.

Ayrıca veriler, salmonella'nın makrofajlara sürekli tutunmasının aktin polimerizasyonu gerektirdiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, çok spektrumlu görüntüleme akış sitometrisi ile nanoparçacıkların ve bakterilerin hücresel internalizasyonunun nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, inhibitörlerin sitotoksik olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu nedenle, kullanılacak optimal konsantrasyonları belirlemek için öncelikle sitotoksisite profilleme deneylerinin yapılması gereklidir. Salmonella ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması ve aerosol oluşumundan kaçınılması gibi önlemlere uyulmalıdır.