Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik nöral tüp içerisindeki hücre davranışlarını yüksek çözünürlükte ve uzun süreler boyunca görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle erken evre nöral tüpün, tekil hücreleri işaretlemek amacıyla seçilen bir floresan proteinin ekspresyonunu yönlendiren bir konstrükt ile transekt edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, erken evre embriyodan kesitler almak ve bunları cam tabanlı kaplara monte etmektir.

İnkübatörde geri kazanımın ardından, embriyo dilimleri belirli aralıklarla geniş alanlı bir mikroskopla görüntülenir. Nihayetinde bu teknik, gelişmekte olan nöroepitelyum içindeki hücre davranışlarının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle uzun süreler boyunca incelenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin canlı doku görüntüleme için mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bireysel hücre davranışlarının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle uzun süreler boyunca gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki; mitotik iğcik oryantasyonunun sülfat seçimindeki rolü veya sinyalizasyon dinamiklerinin hücre davranışını nasıl düzenleyebileceği gibi temel soruları ele almanıza olanak tanır. Plazmidlerin nöral tüpe elektroporasyonu öncesinde, bir dissection mikroskobu altında mikro kapiler çekici kullanılarak cam iğneler hazırlanır. İğnenin ucunu kırmak için ince pensler kullanın.

İğnenin ucu, DNA solüsyonunun enjeksiyonunu engellemeyecek kadar dar olmayacak, ancak nöral tüpü delecek kadar keskin olmalıdır. Bu deney için kullanılan X'ler, Hamilton evresi 10'a ulaşmaları için yaklaşık 36 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiştir.

Bu prosedüre başlamak için, yumurtaya pencere açın ve elektrotları embriyonun her iki yanına beş milimetre ara ile yerleştirip nöral tüpe DNA enjekte edin. Görselleştirme için DNA, az miktarda fast green ile renklendirilmiştir. 12 ila 17 volt akım ve 50 milisaniyelik darbe uzunluğunu, darbeler arasında 950 milisaniye olacak şekilde üç kez uygulayın.

Tekil hücrelerin takip edilebilmesi için mozaik ekspresyon sağlamak amacıyla düşük DNA konsantrasyonları ve düşük elektroporasyon voltajları kullanılır. Son olarak, yumurta kabuğundaki pencereyi şeffaf bantla kapatın ve sızdırmaz olduğundan emin olun. Embriyoların 37 °C'de üç ila dört saat veya gece boyuncale toparlanmasına izin verin.

Kolajen karışımı ve dilim kültür ortamı, embriyolar dilimlenmeden yaklaşık bir saat önce hazırlanmalıdır. Kolajen karışımını hazırlamak için, 300 µL tip 1 kolajene 100 µL %0,1 asetik asit çözeltisi ekleyip iyice vorteksleyin, ardından 100 µL 5X L 15 ortamı ekleyip tekrar iyice vorteksleyin. Çözeltinin rengi sarıya dönmelidir.

Ardından, 15 ila 20 µL %7,5 sodyum bikarbonat ekleyin ve iyice vorteksleyin. Çözelti hafif pembe renge dönmelidir. Buz üzerinde muhafaza edin.

Bu kolajen karışımı her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Dilim kültürü ortamını hazırlamak için, 10 mililitre nörobazal ortam, B 27 takviyesi, glutmax ve Gentamisin çözeltisini ekledikten sonra, ortamı %5 karbondioksit ile tamponlanmış 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Karbondioksit ile dengelenmesi için kabın kapağını en az bir saat boyunca gevşek bırakın.

Bu prosedüre başlamak için, embriyoyu çıkarmak amacıyla küçük bir makas kullanın. Embriyoyu, L 15 medyum ile yıkayarak penset yardımıyla yumurtadan çıkarın. Embriyoyu, tabanında syl guard tabakası bulunan bir doku kültürü kabına yerleştirin.

Embriyoyu, çevreleyen ekstra embriyonik membranlar aracılığıyla membranlar gerginleşene kadar iğneleyin. Bir mikro bıçak kullanarak embriyoyu, ilgi duyulan bölgeden mümkün olduğunca düz bir şekilde kesin. Omurilik kesitleri bir ila iki somit kalınlığında olmalıdır; yaprak kesitleri, diğer embriyolar kesilirken kaybolmamaları için embriyonun lateral dokusuna tutturulmalıdır.

Omurilik kesitlerini cam tabanlı kaba aktarmak için özelleştirilmiş bir mikro pipet ucu gereklidir. Bunu hazırlamak için, bir P2 veya P10 pipete 200 mikrolitrelik bir uç takın ve ucun sonundan yaklaşık bir milimetreyi kesin. Daha önce hazırlanan kolajen karışımından bir mikrolitre hazırlayarak ucun içini kolajen ile kaplayın.

Bir ila iki dakika bekletin ve ardından L 15 medyumu ile durulayın. Bu işlem, dokunun pipet ucunun içine yapışmasını önleyecektir. Şimdi, bir mikro bıçak kullanarak embriyodan bir kesit ayırın ve 200 µL uç takılmış P 2 veya P 10 ile kesiti kaptan çıkarın.

Mümkün olduğunca az besiyeri almaya çalışın. Kollajen karışımını vorteksleyin ve beş ila sekiz µL miktarını, tabanı lamel olan poliol lizin kaplı cam tabanlı bir kaba damlatın; ardından embriyo kesitini hemen kollajenin içine yerleştirin ve ince uçlu bir penset yardımıyla konumlandırın. LIC'ler, görüntülecek olan tarafı lamel ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırılmalıdır.

Dokunun, lamel üzerindeki poli-L-lizin kaplamaya tutunması gerekir. Lamel üzerinde birkaç kesit elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın. Genellikle bir kaba altı ila dokuz kesit yerleştirilir.

Tüm kesitler yerleştirildiğinde, kolajenin bulunduğu en erken bölgeye iki ila üç mikrolitre L 15 besiyeri ekleyin ve kabın kapağını kapatın. Kolajenin 20 dakika boyunca donmasını bekleyin. Kolajen donduktan sonra, %5 karbondioksit ve 37 derece Celsius ortamında en az bir saat boyunca dengelenmiş iki mililitre kesit kültür besiyerini dikkatlice ekleyin.

Kolajenin lamelden yerinden çıkmamasına dikkat edilmeli, lameller 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir inkübatöre yerleştirilmeli ve görüntülemeden önce en az üç saat boyunca toparlanmaya bırakılmalıdır. Doku içindeki hücre davranışlarını uzun süre boyunca, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntülemek zorludur. İyi sonuçlar elde etmek için optimal kültür koşullarının ve beyaz alan mikroskopisinin kombinasyonu gereklidir.

Kesitlerin görüntülenmesi için hava istasyonu çevresel odasıyla donatılmış bir delta vision core geniş alan mikroskobu kullanılır. Oda, mikroskop tablasını %5 karbondioksit ve %95 hava seviyesinde tutan bir karbondioksit perfüzyon aparatı ile sürekli 37 °C'de tutulur. Görüntüleme normalde 40x 1.30 NA yağ daldırma lens kullanılarak gerçekleştirilir ve görüntüler core snap HQ two soğutmalı CCD kamera ile yakalanır. 45 µm'lik doku boyunca her 1,5 µm'de bir Z kesitleri alınır. Pozlama süresi mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır; örneğin 5 ila 50 ms.

Sözü edilen her bir kesit için her yedi dakikada bir görüntüler alınır. Delta görüntüleme sistemleri kullanılarak dokuz dilime kadar ziyaret gerçekleştirilebilir. Burada gösterilen hassas nokta ziyaret fonksiyonu, GFP alfa Tubulin eksprese eden bir konstrükt ile transfekte edilmiş bir spinal kord progenitör hücresinin zamanlapse dizisi örneğidir; görüntüleme, iki günlük HH evre 12 embriyodan alınan bir spinal kord kesiti üzerinde başlatılmıştır.

Bu erken evrede, nöral progenitor hücreler ağırlıklı olarak progenitor progenitor modunda bölünmelere girer ve bu süreçte hücreler, iki adet daha döngüsel progenitor hücre üretmek üzere bölünür. Bu şekil, az önce gösterilen time-lapse dizisinden seçilmiş kareleri göstermektedir. İki saat 20. dakikada hücre, apikal yüzeye dik bir bölünme düzlemiyle bölünerek iki yavru hücre oluşturur.

Bu iki hücre, 24 saat 23 dakika ve 25 saat 54 dakikalarda bir kez daha bölünür. Sıradaki zaman atlamalı sekans, hücre membranını işaretleyen G-F-P-G-P-I ile transfekte edilmiş bir hücreye aittir. Bu hücre, beyaz oklarla belirtilen bazal prosesin ikiye ayrıldığı ve kız hücreler tarafından eşit şekilde miras alındığı bir bölünme geçirir.

Bu hızlandırılmış çekim dizisinden seçilen kareler, hücre bölünmesinin sıfır saat ve 49. dakikada gerçekleştiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, omurilik kesitlerinin nasıl hazırlanacağı ve görüntüleneceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Unutmayın, eğer bu tekniğe yeniyseniz, işlemin başarılı olması için bir araya gelmesi gereken bir dizi teknik açıdan zorlayıcı adım bulunduğu için başlangıçta zorluk yaşayabilirsiniz.