Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Bu deneyin genel amacı, retinal şerit sinapslarındaki zar proteinlerini kantitatif olarak analiz etmek için yeni bir yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntem, devre içindeki sinapslardaki proteinlerin kesin konumu gibi retinal nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, retinal şerit sinapslarında çoklu proteinlerin sayısını, yoğunluğunu ve hızını tahmin edebilmesidir.

Dondurarak ikame etme ve ultra ince kesit alma prosedürünü gösteren NIDCD Gelişmiş Görüntüleme Çekirdeği'nden doktorlarımız Ron Petralia ve Ya-Xian Wang var. Bu işleme başlamak için, mikroskop altında bir göz küresini inceleyin. Bunu yapmak için önce korneayı çıkarın.

Daha sonra lensi ve vitreusu forseps ile retina arası yüzeyden çıkarın. Daha sonra, retina vizör lastiğinden izole edilene kadar sklerayı soyun. Retinayı hemen bir ustura ile 100 200 mikrometre kalınlığında şeritler halinde kesin.

Daha sonra, retina şeritlerini 0.1 molar PB'de% 4 paraformaldehit içinde karıştırın. Daha sonra, oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ve% 0.01 glutaraldehit. PB'de 0.15 milimolar kalsiyum klorür ile birkaç yıkamadan sonra, donma ikamesinden önce retina şeritlerini 0.1 molar PB'de gliserol ile kriyoprotektif. Donmuş dokuyu düz gömme tutuculara yerleştirmeden önce, şeffaf bir plastik tabakadan ince bir daire kesin ve bittiğinde polimerize numune kutusunun daha kolay çıkarılmasını sağlamak için her bir tutucunun altına yerleştirin.

Şimdi, AFS'de otomatik sırayı ayarlayın. AFS'yi sıvı nitrojen ile doldurun ve düz gömme tutucuları AFS'ye yerleştirin. Bunları metanol içinde %1.5 uranil asetat ile doldurun ve önceden soğutun.

Retina şeritlerini 184 santigrat derecede sıvı propan içinde daldırma-dondurmak için, numuneleri daldırma çubuklarının ucundaki metal saplamalara tutturulmuş küçük çift yapışkanlı bant parçalarına yerleştirmek için ince bir fırça kullanın. Bundan sonra, fırçayı kullanarak fazla tamponu fitilleyin. Çubukları yaklaşık beş saniye boyunca sıvı propanın içine daldırın.

Ardından, sıvı nitrojenle doldurulmuş küçük bir taşıma haznesi kullanarak bunları AFS'ye aktarın. Dondurulmuş numuneyi ve aletleri, forseps ve neşteri AFS'ye yerleştirdikten sonra, dokuya dokunmadan önce aletleri haznede birkaç dakika soğutun. Veya aletlerin uçlarını sıvı nitrojenle dolu küçük taşıma haznesine birkaç saniye yerleştirerek soğutun.

Bundan sonra, ince bir neşter kullanarak numuneyi ve bandı saplamadan çıkarın. Daha sonra, metanol içinde %1,5 uranil asetat içeren düz gömme alüminyum tutucudaki yedi kuyucuğun her birine iki parça donmuş bölüm yerleştirin. AFS'de en az 32 saat boyunca 90 santigrat derecede tutun.

Ardından, otomatik sırayla sıcaklığı kademeli olarak 45 santigrat dereceye yükseltin. Bundan sonra, numuneleri önceden soğutulmuş metanol içinde üç kez yıkayın. Daha sonra, bir gömme ortamı olarak düşük sıcaklıkta gömme reçineleri ile numuneleri aşamalı olarak sızdırın.

Ertesi gün reçineyi tekrar değiştirin ve reçine seviyesini kuyuların üst kenarına ulaşacak şekilde ayarlayın. UV ışığını AFS'ye ayarlayın ve otomatik dizinin sonuna kadar numuneleri AFS'de UV ışığı ile polimerize edin. Ardından, numuneleri AFS'den çıkarın.

Tipik olarak, örnek bloklar hala biraz pembelik ve renk gösterir. Numuneleri gece boyunca veya tamamen berrak görünene kadar oda sıcaklığında kimyasal çeker ocakta floresan ışığına yakın bir yere yerleştirin. Bu adımda, 70 adet nonometre kalınlığında ultra ince kesiti bir ultramikrotom ile kesin ve bunları formvar karbon kaplı nikel ızgaralarda toplayın.

Izgaraları bir kez damıtılmış suda yıkayın, ardından üç kez TBS yıkayın. Daha sonra, ızgaraları TBS'de 20 mikrolitre% 5 BSA'da 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 20 mikrolitre keçi anti-CTB ve bir NMDAR alt birimine karşı bir antikor içeren bir karışımda gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bundan sonra, ızgaraları her seferinde ph 7.6'da 20 mikrolitre TBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, ızgaraları beş dakika boyunca ph 8.2'de TBS ile bir kez yıkayın. Izgaraları, 10 nanometre altın parçacıklarına bağlı eşek anti-tavşan IGG ve 18 nanometre altın parçacıklarına bağlı eşek anti-keçi IGG içeren bir karışımın 20 mikrolitresi ile iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, ızgaraları 20 mikrolitre TBS'de, ph 7.6'da üç kez yıkayın, ardından ultra saf suda yıkayın ve ardından ızgaraları havayla kurutun.

Daha sonra, ızgaraları damıtılmış suda sekiz dakika boyunca %5 uranil asetat ile karşı boyayın, ardından karanlıkta beş dakika boyunca damıtılmış suda %0.3 kurşun sitrat ile karşı boyayın. Üçlü etiketleme deneyleri için, ızgaraları gece boyunca oda sıcaklığında 20 mikrolitre keçi önleyici CTB, fare önleyici PSD-95 ve tavşan önleyici UN2A karışımı ile inkübe edin. Daha sonra, ızgaraları 18, 10 ve beş nanometre altın parçacıklarına bağlı 20 mikrolitre IGG karışımı ile iki saat inkübe edin.

Bu bölümde, önce ölçek çubuğunu ayarlayın. Ardından, ImageJ yazılımı ile tek tek RGC dendritlerinin PSD'sinin uzunluğunu ölçün. Ardından, plazma zarı için ortalama yedi ila dokuz nanometre kalınlığa dayalı olarak zarın 10 nanometre içindeki altın parçacıklarını sayın.

Parçacık yoğunluğunu, doğrusal mikrometre başına altın parçacıklarının sayısı olarak hesaplayın. Ardından, sinaptik konum için her bir altın parçacığının merkezi ile PSD'nin ortası arasındaki mesafeyi veya ekstra sinaptik konum için PSD'nin kenarı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu görüntü, GluA2/3 ve CTB'nin çift immünogold etiketlemesini göstermektedir.

Bu pre-sinaptik şerittir ve küçük altın parçacıkları RGC işlemlerinin PSD'sinde kümelenir. Bu görüntü, GluN2B ve CTB'nin çift immünogold etiketlemesini göstermektedir. Küçük altın parçacıkları ekstra sinaptik plazma zarı üzerindedir.

Ve bu görüntü, GluN2A ve CTB'nin çift immünogold etiketlemesini göstermektedir. GluA2/3'e benzer şekilde, küçük parçacıklar PSD içinde kümelenir. GluN2A, PSD-95 ve CTB'nin üçlü immünogold etiketlemesi burada gösterilmektedir.

GluN2A altın parçacıkları ve PSD-95 altın parçacıkları, bireysel CTB-pozitif RGC dendritleri üzerinde PSD içinde birlikte lokalize edilir. Bu prosedürü denerken, dokuyu çok nazikçe sabitlemeyi hatırlamak önemlidir, çünkü NMDA reseptörlerininki gibi bazı protein antijenisiteleri, güçlü uzun süreli fiksasyon ile belirgin şekilde azalır. Bu videoyu izledikten sonra, retinal şerit sinapslarında zar proteinlerini büyük bir hassasiyetle nasıl tespit edeceğinizi ve analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.