Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Bu prosedürün genel amacı, Antarktika'daki Bonnie Gölü'nden protist zenginleştirme kültürleri üretmek ve metabolik çeşitlilik için başlangıç bir gösterge olarak karbon fiksasyonunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle Bonnie Gölü'nde protist ve fitoplanktonların bilinen pik noktalarına karşılık gelen göl suyu derinliklerinden örnekleme yapılarak gerçekleştirilir. Göl suyu örnekleri daha sonra çeşitli büyüme ortamlarına inoküle edilir ve sıcaklık regülatörü ile ışıklarla donatılmış bir büyüme kabininde dört ila altı hafta boyunca inkübe edilir.

Kültürler, gerektiğinde 4 °C'de taşınabilir. Bir sonraki adım, zenginleştirme kültürlerinden ham hücre lizatlarının özütlenmesidir. Bu prosedürün son adımı, ribuloz 1,5 bisfosfat karboksilaz oksijenaz veya Rubisco aktivitesi için bir radyoizotop analizi kullanarak hücre lizatındaki karbon fiksasyon potansiyelini değerlendirmektir.

Nihayetinde, pro zenginleştirme kültürleri, doğal protist topluluğundaki karbon fiksasyonu potansiyelinin değişkenliğini göstermektedir. Bu yöntem, göl mikrobiyal ekolojisine ilişkin temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Örneğin, tabakalı Antarktika göllerindeki karbon döngüsünün çeşitli aşamalarında mikrobiyal ökaryotların rolü gibi.

Zenginleştirme kültürlerinin sonraki nesilleri için su sütunu örneklemesi sık kullanılan bir teknik olsa da, bu yöntem, öngörülemeyen komplikasyonların meydana gelebileceği aşırı soğuk bir ortamda çalışacak şekilde modifikasyonlar içermektedir. Bu yöntemle ilgili fikrim ilk olarak, Redisco analizini doğal göl örneklerinde test etmenin yollarını düşünürken oluştu. Örnekleme alanları birçok araştırmacı için yabancı bir ortamda olduğu için örnekleme adımlarını hayal etmek güçtür; bu nedenle yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Numuneler, Antarktika'daki McMurdo kuru vadilerinde yer alan, kalıcı olarak buzla kaplı çok sayıda gölden biri olan Bonnie Gölü'nden toplanır. Su kolonundan numune almaya bir gün kala, örnekleme sahasını seçin ve hazırlayın. Bu işlem, sondaj ve buz deliği eritme nedeniyle oluşan bozulmanın ardından su kolonundaki katmanlaşmış tabakaların yeniden oluşmasını sağlayacaktır. Su kolonuna erişmek için sondaj sahasının konumunu GPS ile belirleyin.

Dört inçlik bir Jiffy uç uzatma aparatı ve kesme ucu takılı bir Jiffy Ice aga ile buzda delik açarak başlayın; bu işlem matkabın delik içinde donmasını önleyecektir. Sondajı, su sütununun üzerinden yaklaşık dört ila altı inç kala durdurarak sıvı suya girmekten kaçınmaya çalışın. Örnekleme için sondaj deliği altı inçlik çapından iki fete kadar genişletilmelidir.

Bu işlem, ısıtılmış polietilen glikolü bakır bir boru deliğinden sirküle eden sıcak deniz model delik eritici kullanılarak gerçekleştirilir. Eritme işlemi tipik olarak, su sütunu örneklemesinden önceki gün 18 saate kadar sürer. Gerekli tüm ekipmanların ve numune saklama kaplarının örnekleme alanında hazır olduğundan emin olun.

Numune alma malzemeleri arasında beş ila 10 litre kapasiteli bir NICU şişesi, derinliği kalibre edilmiş kabloya sahip bir vinç, her numune alma derinliği için yeterli sayıda numune şişesi, bir haberci ağırlık ve numunelerin taşınması için soğutucular yer alır. Göl suyu filtrasyonunun numune alma gününde tamamlanması gerektiğinden, numune alma işlemine günün erken saatlerinde, yaklaşık 05:00'te başlayın. Kalibre edilmiş bir el vincine bağlı bir kin numune alıcı kullanın.

Bu çalışma için istenen derinliklerden bir ila beş litrelik su örnekleri toplayın. Örnekleme derinlikleri, buz deliğindeki PI simetrik su seviyesinden ölçülen altı metre, 15 metre ve 18 metredir. Göl örneklerini soğutucularda saklayın ve örnekleme alanından saha laboratuvarına taşıyın.

Numuneler, bir ATV'ye bağlı kızak kullanılarak saha laboratuvarında işlenmeli veya stabilize edilmelidir. Örnekleme işleminin hemen ardından, numuneler saha laboratuvarına nakledildiğinde zenginleştirme kültürlerinin kültivasyonuna başlanmalıdır. 0,5 ile bir litre göl suyu, 47 mm 0,45 µm gözenek boyutuna konsantre edilmelidir.

Hafif filtrasyon kullanarak POLİETERSülfon filtreler uygulayın. Doğal topluluğun çeşitliliği isteniyorsa, ikinci bir örneği 47 milimetre, 0.45 mikron gözenek boyutuna filtreleyin.

POLİETER sülfon filtreleri sıvı azot içinde hızlı dondurma işlemine tabi tutun. Her bir filtreyi, filtrenin alındığı aynı örnekleme derinliğinden toplanmış yaklaşık 20 mililitre filtrelenmiş göl suyu içeren 50 mililitrelik steril falcon tüpüne aktarın.

Farklı kültür ortamlarında zenginleştirmeler yapmak için hücre süspansiyonunu 25 santimetrekarelik steril bir hücre kültür balonuna aktarın. Her örnekleme derinliği için birden fazla tekrar hazırlayın. Her kültür balonuna aşağıdaki kültür ortamlarının 50 x steril çözeltilerini ekleyin: bold basil, medium, BG 11 ve F iki.

Karışık atrofik organizmaların kültürlenmesi gerekiyorsa, iki adet F iki takviyeli kap hazırlayın ve gönderimden önce, ABD laboratuvarına gönderilmek üzere, inkübasyon kültür flasklarından birine iki ila üç adet steril pirinç tanesi ekleyerek düşük sıcaklık ve düşük radyans değerlerinde, sıcaklık kontrollü bir büyüme inkübatöründe en az dört hafta boyunca bekletin. Zenginleştirme kültürlerini steril 50 mililitrelik Falcon tüplerine aktarın. Nakliye talebinde "dondurmayın" ve "serin tutun" gönderim gereksinimlerini belirtin. ABD'ye ulaştığında, her bir zenginleştirme kültüründen beş mililitreyi, 125 mililitrelik bir kaba konulmuş 45 mililitre uygun büyüme besiyerine aktarın.

Steril bir süngerle kapatılmış steril erlen may flask. Zenginleştirme kültürlerini, sıcaklığı kontrol edilen dört derece santigrat derecelik bir çevresel büyütme odasında sabit kültürler olarak muhafaza edin ve her 30 günde bir transfer kültürlerini taze medyuma aktarın. Hücre lizatı ekstraksiyonu prosedürüne başlamak için, beş litre zenginleştirme kültürünü hafif vakum kullanarak 25 milimetrelik bir watman GFF filtre üzerinden süzün.

Ardından, filtreyi steril çelik makasla dört ila beş bölüme ayırın. Daha sonra, parçaları steril pensler yardımıyla, beşten birine kadar 0,1 mm çapında doldurulmuş iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.

Zirkonya silika boncuklar. Tüpe 1,25 mililitre filtre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve ardından hücreleri, 48 hız ayarında 30 saniye boyunca bir mini boncuk kırıcı (bead beader) kullanarak parçalayın ve ardından bir dakika boyunca buzda bekletin. Örnek santrifüjünün ısınmasını önlemek için, boncuk kırma işlemini, her işlem arasında bir dakikalık buz inkübasyonları olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.

Süspansiyonu, GFF filtre lifleri ve hücre duvarı kalıntılarından oluşan gevşek bir pellet oluşturmak için 4 °C'de 3000 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Pelletten 200 µL'lik bir miktar alın ve 800 µL buz soğukluğunda %90 asetona daldırın.

Kalan süpernatantı 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ekstraktlanabilir klorofil A miktarını, bir spektrofotometrede 664 nanometre ve 647 nanometre dalga boyu değerlerinde ölçün. Kalan süpernatantı dört santigrat derecede, 15.000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Çözünmeyen hücresel membran peletini ve kalan GFF filtre liflerini almamaya dikkat ederek S'yi temiz bir 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu çözünür hücre lizatı, bir sonraki bölümde gösterilecek olan rubis karboksilaz aktivite analizinde kullanılabilir. Bu analize başlamak için, her bir çözünür lizattan 125 mikrolitreyi buz üzerinde soğutulmuş 1,5 vidalı kapaklı mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Negatif kontrol örnekleri için, 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpüne 125 µL çözünür lizat ekleyin ancak substrat eklemeyin. Daha sonra tüm örnekler ve negatif kontroller için paralel reaksiyonlar gerçekleştirin. 10 mL taze analiz tamponu hazırlayın ve buz üzerinde soğutun.

Tüm örnekler ve negatif kontroller için yeterli miktarda analiz tamponunu beş mililitrelik bir tüpe ekleyin. Bu noktadan itibaren tüm adımlar bir çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir. Belirlenen tampona C 14 işaretli sodyum bikarbonat ekleyin ve tamponu buz üzerinde tutun.

C 14 içeren assay tamponundan 10 µL alarak bir mililitre assay tamponu ile seyreltin ve karıştırmak için ters çevirin. Seyreltilmiş karışımın 100 µL'sini bir sintilasyon şişesindeki üç mililitre bios safe two sintilasyon sayım kokteyline ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. C 14 sayımlarını Beckman LS 6, 500 sayacı ile ölçün; analize devam etmeden önce sintilasyon sayımları dakikada 18.000 sayımın üzerinde olmalıdır.

Analiz tamponuna yeterli miktarda C 14 işaretli sodyum bikarbonat eklendikten sonra, reaksiyon tüplerini 25 °C'ye önceden ayarlanmış bir kuru banyoya taşıyın ve üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, lizatlara 100 µL analiz tamponu ekleyin ve 25 °C'de beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, her örneğe ribuloz bisfosfat ekleyin ve reaksiyonun 25 °C'de beş ila 10 dakika sürmesini sağlayın.

Reaksiyonu durdurmak için 100 µL %100 probiyotik asit ekleyin; bağlanmamış C 14'ü uzaklaştırmak için 2000 ×g'de bir saat boyunca santrifüjleyin. Son olarak, numunelerin toplam hacmini, üç mL bios. safe 2 sintilasyon sayım kokteyli içeren sintilasyon tüplerine aktarın ve asit stabilindeki dakika başına sayımı (CPM) belirleyin.

Sintilasyon sayımı ile son ürünler belirlenmiştir. Antarktika'daki Bonnie Gölü'nden üç farklı derinlikten yeni, soğuğa adapte fototrofik ve miksatrofik protistleri izole etmek için zenginleştirilmiş kültür yöntemi kullanılmıştır. Daha geniş bir organizma çeşitliliğini seçebilmek için Bold's Basal Medium (BBMF 2), deniz ortamı ve BG 11 ortamı gibi çeşitli büyüme ortamı türleri kullanılmıştır.

Bu tabloda gösterilen besin konsantrasyonu ve fotosentetik olarak aktif radyasyon veya PAR, numune toplama anındaki koşulları temsil etmektedir. Zenginleştirme kültürlerinin ışık mikroskobu ile yapılan görsel incelemesi, çoğu hücrede klorofil pigmentinin bulunmasıyla belirtildiği üzere, kültürlerin fototrofik protistler tarafından domine edildiğini ortaya koymuştur. Kültürler ayrıca, inokülumun alındığı örnekleme derinliğine ve kültürde kullanılan besiyeri tipine bağlı olarak çeşitli hücre morfolojileri barındırmaktaydı.

Karbon fiksasyonuna yönelik bir gösterge olarak, rubis enzimi tarafından katalize edilen karboksilaz aktivitesinin maksimum hızları zenginleştirilmiş kültürlerde ölçülmüştür. Burada gösterildiği üzere, fototrof protist biyokütlesine dair bir tahmin olarak potansiyel klorofil a bolluğu da izlenmiştir.

Tüm kültürlerin aynı sıcaklık ve ışık rejimi altında kültüre edilmesiyle beraber, karbon fiksasyon potansiyeli ve fototrofik biyokütle zenginleştirme kültürleri arasında çarpıcı farklılıklar göstermektedir. Maksimum rubis O aktivitesi, BBM medyumunda büyüyen dört ve altı numaralı zenginleştirme kültürlerinde ve BG 11 medyumunda büyüyen 13 ve 14 numaralı zenginleştirme kültürlerinde gözlemlenmiştir. Buna karşılık, F iki büyüme medyumunda zenginleştirilen 1921 ve 23 numaralı kültürler, dört ila 34 kat daha düşük maksimum karboksilaz aktiviteleri sergilemiştir.

Karboksilaz aktivitesi klorofil a bazında ifade edildiği için bu farklılıklar, F iki kültürlerindeki daha düşük biyokütle seviyelerinden kaynaklanmamıştır. Ayrıca, Pearson korelasyon analizi, rubis co aktivitesinin klorofil a konsantrasyonu ile korelasyon göstermediğini ortaya koymuştur. Altı metre ve 15 metreden alınan göl suyu ile inoküle edilen BBM kültürleri.

Zenginleştirme forum beş en yüksek klorofil A seviyelerine sahipken, diğer tüm kültürler rubis enzim aktivitesinden bağımsız olarak nispeten düşük klorofil a sergilemiştir. Uzmanlaşıldığında, göl örnekleme tekniklerinin uygulanması yaklaşık iki saat sürer. Kaç örnek alındığına bağlı olarak, düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde karboksilaz analizi de iki saat sürer. Bu prosedürün ardından, heterotrofların hangi derinlikte oluştuğu gibi ek soruları yanıtlamak için heterotrofik enzim aktivitesi analizi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Tamam, bu videoyu izledikten sonra, göl örneklerinin nasıl toplanacağı, bunların üretimi için nasıl zenginleştirileceği ve rubis karboksilaz aktivitesinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.