Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Bu prosedürün genel amacı, hücre lizatlarından mono zon ve polizom fraksiyonlarını ayırmak ve karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise hücre lizatının hazırlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, lizatı bir sükroz gradyanı aracılığıyla santrifüj etmektir. Prosedürün son adımı ise gradyanı fraksiyone etmek ve farklı ribozomal popülasyonları bir UV izi aracılığıyla görselleştirmektir. Nihayetinde, poliribozom profil analizi yoluyla farklı deneysel koşullar altında translasyondaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben UMD ve J Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi'nin Moleküler Genetik, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji bölümünde Dr. Terry Goss Kinsey'nin laboratuvarından Anthony Esposito. Ben de Marcus Lewis, yine buradaki R-W-J-M-S'deki Kinsey Laboratuvarı'ndanım.

Bugün size poliribozom analizi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, mutasyonlar veya çevresel faktörlerden kaynaklanan protein sentezi değişikliklerini incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım. Sükroz.

Gradyanların süreklilik kazanması için, kullanımdan bir gün önce hazırlanması gerekir. Aşağıdaki sakroz konsantrasyonlarının her birinden 48 mililitre hazırlamak için %7 ve %47'lik sakroz stok çözeltilerinin uygun hacimlerini karıştırın: %7, %17, %27, %37 ve %47. Her sakroz çözeltisine, nihai konsantrasyon bir milimolar olacak şekilde bir molar DTT ekleyin. Gradyanları dökmek için, para film ile sabitleyip sızdırmaz hale getirerek bir pasta pipeti 20 mililitrelik bir şırıngaya takın.

Bir inç x 3,5 inç boyutundaki bir polimer ultra santrifüj tüpünün tabanına yedi mililitre %7 sükroz ekleyin. Ardından, pastör pipet ucunu tüpün tabanına yakın tutarak ve yavaşça pipetleme yaparak, %7'lik çözeltinin altına yedi mililitre %17 sükroz çözeltisi ekleyin. Her bir katmanın dökülmesi 20 saniyeden az sürmemelidir.

Gradyan oluşturulduğunda, işlemini %27, %37 ve %47'lik sakroz çözeltilerinin her birinden yedi mililitre kullanarak tekrarlayın. Katmanlar arasında, minimum düzeyde karışımın gerçekleştiğini gösteren net çizgiler gözlemlemelisiniz. Tüm gradyanları, örnekleri toplamak için kullanılacak rotorlar, şişeler ve tüplerle birlikte dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın.

Maya hücrelerinden ekstrakt hazırlamak için, öncelikle 25 mililitrelik maya kültürlerini 0,8 ile 1 arasında bir OD 600 değerine ulaşana kadar büyütün. Kültüre, nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde sikloheksimid ekleyin ve 30 °C'de 15 dakika boyunca çalkalamaya devam edin. 15 dakika sonra, kültürü 250 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın ve etrafını buzla doldurun.

Bu noktadan itibaren her şeyi buz üzerinde tutun; 4 °C'de, 8.000 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellet'i 10 mL buz soğuk liziz tamponu içerisinde yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik polipropilen tüplere aktarın. 4 °C'de, 5.900 ×g hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Pelleti 0,5 milliliters lizis tamponunda süspanse edin. Süspansiyonu 1,5 milliliter mikro santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 0,5 milliliters soğutulmuş, asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Hücreleri, her aralık arasında tüpü 30 saniye boyunca buz üzerinde tutarak, 32 saniyelik dört aralıkla vorteksleyin.

Ardından, 1,5 ml'lik santrifüj tüpüne 0,5 ml daha lizis tamponu ekleyip 4 °C'de beş dakika boyunca 5.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.

Son olarak, süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ekstrakt, lizatı sakroz gradyanına aktarana kadar minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta saklanabilir. Pipet ucunu tüpün duvarına, gradyanın yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve lizatı nazikçe gradyanın üzerine katmanlar halinde ekleyin.

35 mililitrelik bir gradyan için tipik olarak 500 mikrolitre lizat yüklenir. Forseps kullanarak gradyanı bir salınımlı kova rotorunun kovasına dikkatlice yerleştirin. Gradyanları dört derece Celsius'ta dört saat boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin.

Dört saatlik santrifüj işleminin tamamlanmasına yaklaşık 30 dakika kala, iğneyi tüp deliciye ve kalemi çevrimiçi absorbans floresan monitörüne takın. Numuneleri analiz etmeden önce stabil bir baz hattına ulaşılmasını sağlamak için absorbans monitörünün gücünü açın.

PolyZone profilinin elektronik kazanımı, bir DI 1 48 U veri toplama ünitesi bağlanarak gerçek zamanlı olarak kolayca elde edilebilir. Grafik kaydediciye, şırınga pompasını ters akış hızlı ayarını kullanarak 50 mililitre florin nuts ile doldurun. Hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.

Şırıngadan gelen hortumu tüp deliciye bağlayın. Ardından, Flo inert akışını ileri yönde dakikada altı mililitre hızında kısa süreliğine başlatın. Hortumdaki hava kabarcıklarını temizlemek için, akış hücresinin sonundaki hortumun altına numune akışını toplamak amacıyla bir dizi tüp yerleştirin.

Sükroz gradyanını içeren santrifüj tüpünü tutmak için önceden hazırlanmış bir yuvası olan bir buz kovası hazırlayın. Dört saatlik santrifüjleme işlemi tamamlandığında, santrifüj tüplerini santrifüj rotorundan dikkatlice çıkarın ve gradyanları bozmamaya özen göstererek buz üzerine yerleştirin.

Hücre ekstraktlarını analiz etmek için, gradyan tüpünü tüp delicisine yerleştirin, tüpün üst kısmını çıkışa bağlayıp sabitleyin. İğnenin tüpün alt kısmını delmesi için alt platformu santrifüj tüpüne doğru yükseltin. Florin alert akışını ileri yönde, dakikada altı mililitre hızında başlatın.

Flut tüpe akmaya başladığında, çevrimiçi UV absorbans monitöründeki iğnenin hareketini izleyin. İğne hareket etmeye başladığında, grafik hareketini 60 hız ayarına getirin. Poliribozom profilinin sonuna gelindiğinde, santrifüj tüpüne giden Flo inert akışını kapatın ve absorbans floresan monitöründeki grafik hareketini durdurun.

Sükrozun tüpten şırıngaya çekilmediğinden emin olarak, akışı hızlı bir hızda ters yönde başlatıp Flo inerti santrifüj tüpünden şırıngaya geri çekin. Santrifüj tüpünü tüp delici düzenekten sökün, iğneyi indirin ve tüpü çıkarın. Burada, cyclo heximide varlığında mayadan hazırlanan bir ribozom ekstraktının temsili bir izi gösterilmektedir.

Poliribozomlar ile 60 s ve 40 s ribozomlarını içeren UV absorbsiyon pikleri belirtilmiştir. Bu prosedürü gerçekleştirirken poliribozom analizinin nasıl yapılacağını size göstermiş olduk. Bu işlemi yaparken hızlı çalışmaya, örnekleri soğuk tutmaya ve RNA'ları kontaminasyondan uzak tutmaya özen göstermek önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.