Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Negatif zincirli RNA virüsleri. İnfluenza virüslerinin genomu, tek zincirli genomun nükleer protein tarafından kapsüllendiği ve PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinden oluşan polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri veya VRNP'ler şeklinde paketlenir. Enfekte memeli hücrelerinden bozulmamış kompleksleri saflaştırmak için HeLa hücreleri, rekombinant strept-etiketli influenza virüsü ile inkübe edilir.

Virüs hücrelere girdikten sonra, enfeksiyonu takiben çekirdeklerde viral RNA sentezlenir; hücreler bir deterjan kullanılarak parçalanır ve santrifüj ile salt-bazlı kromatin fraksiyonu protokolü kullanılarak sitoplazmik, nükleer ve kromatin fraksiyonlarına ayrılır. Son olarak, strept-etiketli VRP'ler her bir fraksiyondan afinite yöntemiyle saflaştırılır. Saflaştırılmış vRNP'lerin protein ve RNA kompozisyonunun gümüş boyama ile analizi, bu protokolün kullanılmasıyla kromatine sıkıca bağlı VRP'lerin bile bozulmadan izole edilebileceğini göstermektedir. Dolayısıyla, influenza virüsü ribonükleoprotein komplekslerinin afinite ile saflaştırılmasına yönelik standart yöntemlerle karşılaştırıldığında protokolümüzün temel avantajlarından biri, yöntemimiz sayesinde, influenza virüsü mRNA sentezi bölgesi olduğu bilinen enfekte hücrelerin kromatininden vRNP'leri saflaştırmanın mümkün olmasıdır.

Böylece yöntemimiz, örneğin hangi viral veya hücresel faktörlerin ve hangi translasyon sonrası modifikasyonların viral mRNA sentezi veya viral genomik RNA sentezi için gerekli olduğu gibi, viral replikasyon ve transkripsiyonun düzenlenmesine ilişkin soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yönteme yeni başlayan araştırmacılar bazı zorluklarla karşılaşabilirler; çünkü subnükleer fraksiyonlama biyokimyasal koşullara karşı çok hassastır ve farklı hücre hatları arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Bu protokole, PB2 alt biriminin C terminusine genetik olarak strep etiketi eklenmiş olan influenza virüsü RWSN PB2 strep ile 3 enfeksiyon multiplicitiesi (MOI) değerinde enfekte edilmiş hücrelerimizle başlayın.

Hücreleri bir kez soğuk PBS ile yıkayın, ardından 12 mililitre soğuk PBS ekleyin ve hücreleri kapla bir kauçuk sıyırıcı yardımıyla çıkarın. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjle çöktürün.

Bu prosedürün en zor yönü hücre fraksiyonlama protokolüdür. Hücre çekirdekleri homojenizasyon ve karıştırma işlemlerine karşı çok hassastır ve bu işlemler yanlış yapıldığında, bir kromatin ekstraktı kolayca bozulabilir. Bu nedenle, sadece homojenizasyon tekniklerine değil, burada gösterdiğimiz lizatların genel kullanım şekline de uymak oldukça önemlidir.

Santrifüj aspirasyonu, PBS ve Resus işlemlerinin ardından, hücre peletini 10 milliliters soğuk sakkaroz tamponunda süspande edin. 10 milliliter plastik serum pipetine 200 microliter pipet ucu takın ve hücre kümelerini parçalamak için hücreleri buradan geçirin. Süspansiyonu 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Hücreleri yeniden süspand etmek için periyodik olarak nazikçe altüst edin. Ardından, son konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde non IET P 40 ekleyin ve 15 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin; hemen ardından masaüstü santrifüjde dört derece Celsius'ta 3, 500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.

Süpernatantı dört santigrat derecede saklayın. Bu bir sitoplazmik fraksiyondur. Pellet, burada gösterildiği gibi orijinal hücre pelletinden daha küçük ve daha beyaz olmalıdır.

Protokol daha sonra tamamlanacaksa, hücre peletini dört derece Celsius'ta saklayın. Aksi takdirde, peleti beş mililitre soğuk sakroz tamponu ile yıkayarak ve önceki adımlardaki gibi santrifüj ederek devam edin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı dökün ve çekirdekleri içeren peleti 1,5 mililitre soğuk nükleer plazmik ekstraksiyon tamponunda yeniden süspande edin.

Yeniden süspande edilen peleti, sıkıca oturan bir havanı olan soğutulmuş dört mililitrelik cam bir Dounce homogenizatörüne aktarın ve çekirdekleri 20 vuruşla homogenize edin. Köpürmeden kaçınarak, yaklaşık 10 vuruş sonra direncin artması gerekir. Etkili homogenizasyonu doğrulamak için örneği bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.

Çekirdekler artık yuvarlak olmamalı, düzensiz formlar sergilemeli ve sanki patlamış gibi görünmelidir. Çekirdekler homojenize edildikten sonra, bunları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Homojenatı döner bir düzenek üzerinde, dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, bir mikro santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 ×g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, nükleoplazmik fraksiyon olan süpernatantı 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de saklayın. Daha sonra peleti, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 1,5 mL sindirim tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından fraksiyonu 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, sodyum klorürün nihai konsantrasyonunu 150 mM'ye getirmek için 42 µL beş molar sodyum klorür ekleyin ve ardından buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Dört derecelik bir mikro santrifüj cihazında 16,000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve 4 °C'de saklayın. Bu, CH one 50 fraksiyonudur. Pelleti 1,5 mL soğuk yüksek tuzlu tampon çözeltide resüspend edin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.

Mikrosantrifüjde, 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve 4 °C'de saklayın. Bu, CH 500 fraksiyonudur.

Fraksiyonlama protokolü sırasında saklanan fraksiyonları çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Ardından sitoplazmik fraksiyona, 300 µL beş molar sodyum klorür ekleyin. Sonra, fraksiyon başına 100 µL paketlenmiş strep T Sphero boncuklarını 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

Boncuklara 10 hacim strep yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için tüpü ters çevirin ve masaüstü santrifüjde 1000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın.

Tampon yıkamasını iki kez tekrarlayın ve ardından pelletini eşit hacimde strep yıkama tamponunda yeniden süspande edin; her fraksiyona 200 µL yıkanmış strep-aktin boncuk süspansiyonu ekleyin. Tüpleri 4 °C'de bir saat boyunca döndürün. Ardından tüpleri 4 °C'de 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Ardından, 15 mL'lik bir tüpte sitoplazmik fraksiyon ile inkübe edilen boncuklara bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu ekleyin ve boncukları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Boncukları bir dakika boyunca yıkayın, ardından tüpleri 4 °C'de 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Son yıkama adımından sonra işlemi iki kez tekrarlayın. Yıkama tamponunun tüm kalıntılarını düz bir pipet ucu kullanarak temizleyin. Ardından 100 µL elüsyon tamponu ekleyip nazikçe karıştırın ve tüpleri 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

İnkübasyon sırasında, tüplerin altına hafifçe vurarak boncukları ara ara karıştırın. 15 dakika geçtikten sonra, 4 °C'de 1000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Elüye edilmiş strep etiketli VRP'leri içeren süpernatantı toplayın.

Hücrelerimiz dokuz saat boyunca influenza virüsü suşu WSN ile enfekte edilmiş ve fraksiyone edilmiş lizatlar burada gösterildiği gibi western blotting ile analiz edilmiştir. Nazik nükleer izolasyon, bol miktardaki nükleer proteinlerin salınımını önlerken tubulin gibi sitoplazmik proteinleri etkili bir şekilde ekstrakte eder. Düşük tuz ile ekstrakte edilen kromatin fraksiyonunun, transkripsiyon için önemli proteinler açısından zenginleştiğine dikkat edin.

Yüksek tuz fraksiyonu temel olarak nükleozomlar içerirken, etiketsiz virüs, RWSN veya RWSN PB2-strep ile dokuz saat boyunca enfekte edilmiş R hücrelerinden elde edilen elüye sitoplazmik fraksiyonun protein kompozisyonunu belirlemek için gümüş boyama ile analiz edilmiştir (bir sitoplazmik elüat için gösterildiği gibi). Burada, 95 ve 100 kilodalton arasındaki bantlara kıyasla 55 kilodaltonun üzerindeki ana bandın belirginliğiyle kanıtlandığı üzere, NP'nin PA, PB1 ve PB2'ye oranının yüksek olduğu görülmektedir; bu durum, çoğu strep PB2'nin tamamen oluşmuş bir vRNP'nin parçası olarak saflaştırıldığını veya başka bir ifadeyle, göreceli verimleri karşılaştırmak için çok az çözünür polimerazın yakalandığını göstermektedir. RWSN PB2-strep veya RWSN ile dokuz saatlik enfeksiyonun ardından saflaştırılan vRNP'ler, bu gümüş boyama jelinde gösterildiği gibi gümüş boyama ile analiz edilmiştir; vRNP'ler dokuz saatlik enfeksiyonun ardından dört hücresel fraksiyonun tamamından saflaştırılabilir.

v RMP'lerin en yüksek konsantrasyonu nükleer plazmada bulunur, ancak önemli miktarları sitoplazma ve kromatin üzerinden de saflaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, enfekte hücrelerin çekirdeğinden yüksek verimli ve bozulmamış influenza virüsü ribonükleoprotein komplekslerinin nasıl saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü gerçekleştirirken, temiz tamponlar kullanmayı ve örneklerin gereksiz yere oda sıcaklığına maruz bırakılmamasını hatırlamak önemlidir; çünkü bu sayede hem RNA ve protein degradasyonunu hem de protein kompleksinin dağılmasını önleyebilirsiniz.

Bulaşıcı bir influenza virüsüyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Lizatlara NP 40 eklenene kadar tüm adımlar, biyogüvenlik düzeyi iki çalışma tezgahında gerçekleştirilmelidir.