Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli insan endotel hücrelerini izole etmek ve bunları alt akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin izole edilmesi ve ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin IBD odacıklarına bölünmesidir.

Ardından, taze olarak izole edilen insan nötrofilleri aktive edilmiş endotel hücrelerinin üzerine yayılır; bu durum nötrofil yuvarlanması, sıkı yapışma ve transmigrasyon ile sonuçlanır. Son adım, video mikroskobu kullanarak transmigrasyonun miktarının belirlenmesidir. Nihayetinde, aktive edilmiş endotel hücreleri üzerinden nötrofil transmigrasyonunu değerlendirmek için floresan ve parlak alan mikroskobu kullanılabilir.

Endotel hücre izolasyonunu tanımlamak kolaydır, ancak temel adımların göbek kordonunun görselleştirilmesini gerektirmesi nedeniyle öğrenmesi zordur. Bu nedenle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, lökosit göçünün akış koşulları altında nasıl gerçekleştiği gibi inflamasyon alanındaki temel soruları anlamamıza yardımcı olacak ve endotel hücrenin akış koşulları altındaki davranışlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Bu yöntem enflamasyon sırasında nötrofil göçü hakkında bilgi sağlayabilse de, doğal öldürücü hücreler ve eozinofiller gibi nadir lökosit popülasyonlarına da uygulanabilir. Bu prosedürü Ritu Sharma ile birlikte laboratuvarımdaki teknisyen Hong Jang uygulamaktadır. Prosedürden en az bir saat önce, jelatin içeren bir T 75 flaskı 37 °C'de inkübe edin.

Ardından, bir makas kullanarak plasentadan bir göbek kordonu keserek laminar akışlı kabinde endotel hücre izolasyon prosedürüne başlayın. Steril eldivenleri giydikten sonra kordonu dikkatlice inceleyin ve kan pıhtıları içeren veya doğum sırasındaki kordon klempleme işlemi nedeniyle hasar görmüş bölümleri atın. Daha sonra kordonda bulunan iki arteri ve tek veni belirleyin.

Ardından, ucuna iki yollu stop musluğu takılı bir kanülü venin bir ucuna nazikçe yerleştirin ve ardından kanülü konumunda sabit tutmak için etrafına bir klemple sabitleyin. Prosedürün en zor kısımlarından biri göbek kordonunun perfüzyonudur. Bunun başarılı bir şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için, kordonu fazla miktarda tampon çözelti ile perfüze edin ve akış şeffaf hale gelene kadar izleyin.

Akış berraklaşana kadar veni kordon tamponu ile perfüze edin ve ardından kordonun ucunu klempleyiniz. Perfüzyon sırasında, hekimlerin göbek kordonundan kordon kanı almış olması nedeniyle bazen küçük bir delik ortaya çıkabilir. Bu durumlarda, delikleri kapatmak için hemostatlar kullanılabilir ve endotel hücreleri izole edilirken perfüzyona devam edilebilir.

Kollajenaz işleminin zamanlamasını hassas bir şekilde ayarlamak kritik önem taşır. Sürenin çok kısa tutulması durumunda yeterli endotel hücre hasadı yapılamaz; sürenin çok uzun tutulması ise kontamine edici düz kas hücrelerinin oluşmasına veya endotel hücrelerinin hasar görmesine yol açabilir. Ardından, veni taze hazırlanmış sıcak kollajenaz ile perfüze edin.

Musluğu kapatın ve kordonu, içinde ılık kordon tamponu bulunan bir behere yerleştirerek inkübe edin. 10 dakika sonra kordonu çıkarın ve endotel hücrelerini ven lümeninden ayırmak için kordona nazikçe masaj yapın. Çözeltiyi, beş mililitre endotel hücre medyumu veya ECM içeren bir tüpe boşaltın; kalan hücreleri temizlemek için kordonu iki kez kordon tamponu ile yıkayın.

Şimdi hücreleri 10 dakika boyunca 350 ×g'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında süpernatantı uzaklaştırın ve ardından peleti yeniden süspande edin. Hücreleri 10 mL endotel hücre medyumu içinde, jelatin kaplı T 75 flaskına aktarın ve endotel hücrelerini gece boyunca 37 °C ve %5 CO2 koşullarında kültüre edin. Ertesi gün, herhangi bir eritrositi yerinden ayırmak için flaskı hafifçe sallayın.

Ardından süpernatanı uzaklaştırın ve endotel hücre kültürünü ılık HBSS ile yıkayın. HBSS'i uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 10 milliliters ılık ECM ile besleyin. Daha sonra, eritrositlerin uzaklaştırıldığından emin olmak ve endotel hücrelerinin konfluens derecesini ve morfolojisini değerlendirmek için hücreleri mikroskop altında inceleyin.

Hücreler konfluansa ulaşana kadar her üç günde bir besiyerini değiştirmeye devam edin. Bu noktada, hücreleri tripsin ve EDTA çözeltisi kullanarak ayırın. Ardından ayrılan hücreleri toplayın ve ECM içinde yeniden süspande edin.

Son olarak, bir IBD odacığının her kuyucuğunu jelatin ile kaplayın. Fazla jelatini uzaklaştırın ve ardından odacığın her kuyucuğuna mililitre başına 1,5 × 10⁶ endotel hücre süspansiyonu ekleyin. Endotel hücreleri aktive edilirken, hücreleri uygun bir stimülan ile inkübe ederek adezyon ve aktivasyon molekülleri hücre yüzey ekspresyonunun yukarı regülasyonunu indükleyerek başlayın.

Sağlıklı insan gönüllülerin periferik kanından nötrofilleri, daha önce yayınlandığı üzere yoğunluk gradiyentli santrifüj ile izole edin ve ardından hücreleri HBSS artı insan albümin içerisinde mililitre başına 1 × 10⁶ konsantrasyonda süspande edin. Mikroskobu kurduktan sonra, stimüle edilmiş endotel hücrelerini içeren IBD haznesini mikroskobun tüplerine bağlayın. 10x faz kontrast objektifini seçin ve ardından şırınga pompasını, istenen kayma geriliminde HBSS akışını başlatacak şekilde çekme moduna ayarlayın.

Çıkış tarafındaki üç yollu musluğu kapalı konuma getirip giriş hattını HBSS'den izole nötrofillere geçirerek akışı kısa süreliğine durdurun. Musluğu tekrar açık konuma getirerek akışı yeniden başlatın. Ardından, bir DVD kaydediciye bağlı bir CCD kamera kullanarak kayda başlayın.

Zamanlayıcıyı başlatın. Dört dakika sonra nötrofiller hazneye girdiğinde, yeni nötrofillerin yapışmasını önlemek için tekrar HBSS'ye geçin. Toplam etkileşimler, yuvarlanma ve sıkı yapışma verileri isteniyorsa, 10x faz kontrastı kullanın.

Dördüncü ve beşinci dakikalar arasında, her biri 10 saniye boyunca altı rastgele alanı görüntülemek için objektifi ayarlayın. Son olarak, 40x objektife geçin ve ilgi duyulan zamanda tek bir görüş alanını kaydedin. 10. dakikadaki nötrofil perfüzyonundan sonra, beş ile 10 arasında rastgele görüş alanı toplayın.

Uyarılmamış endotel hücreleri nötrofil göçünü desteklemez. Bu nedenle, aşağıdaki şekillerde TNF alpha ile uyarılmış endotel hücreleri ile etkileşime giren nötrofiller gösterilmektedir. Sarı ok başı ile belirtilen yapışmış nötrofile ve beyaz ok başı ile gösterilen transmigrasyon halindeki nötrofile dikkat ediniz.

Nötrofil transmigrasyonu, hücre bağlantılarında veya endotel hücrelerinin kendileri aracılığıyla gerçekleşebilir. Bu iki durum arasındaki farkı ayırt etmek için endotel hücreleri, anti VE koherent bir antikor ile işaretlenmiştir. Burada kırmızı renkte görüldüğü üzere, transmigrasyon paraselüler veya transselüler olarak skorlanmaktadır.

Bu modelde, önceki iki şeklin üst üste bindirilmiş halini gösteren bu şekille kanıtlandığı üzere, transmigrasyonun neredeyse tamamı parasellülerdir. Üç grafikten ilki olan bu grafikte, nötrofil etkileşimleri Image J yazılımı kullanılarak incelenmiş ve ölçülmüştür. Nötrofiller ile TNF alpha aktive edilmiş endotel hücreleri arasındaki nötrofil endotel hücre etkileşimlerinin, kontrol grubu olan uyarılmamış endotel hücrelerine göre anlamlı derecede daha fazla gerçekleştiğine dikkat edin.

Toplam etkileşen hücreler; daha önce olduğu gibi yuvarlanan, sıkıca yapışan veya transmigrasyon yapan hücreler olarak daha ayrıntılı şekilde karakterize edildi. Endotel hücrelerinin izolasyonunun ardından, aktive edilmiş endotel hücreleri içeren kuyucuklarda anlamlı derecede daha fazla nötrofil transmigrasyonu gerçekleşti. Gelişim sonrası, endotel hücresi biyolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla western blotting, real-time PCR ve endotel direnci gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu yöntem, enflamasyon ve vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, insan model sisteminde akış koşulları altında lökosit göçünün nasıl gerçekleştiğini anlamalarına yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin nasıl izole edileceği ve bir ity kamarası kullanarak akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu incelemek için bu hücrelerin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.