Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Bu prosedürün genel amacı, tek bir oosit içindeki DNA metilasyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle toplanan oositlerden kumulus hücrelerinin ve soap palita'nın uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, eser miktardaki DNA'nın kaybını veya degradasyonunu önlemek için oositin ikiye bir oranında aros lizis çözeltisine gömülmesidir.

Ardından bisülfit mutajenezi gerçekleştirilir ve bunu iç içe polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla amplifikasyon izler. Son adım, PCR ürününün ligasyonu ve klonlanmasıdır. Daha sonra klonlar seçilir, PCR ile amplifiye edilir ve dizileme için gönderilir.

Nihayetinde, bisülfit mutajenezi ve dizileme, tek bir oosit içerisindeki ilgi duyulan bir bölgedeki sitozin fosfat guanin veya CpG dinükleotidlerindeki DNA metilasyonunu göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, çok sayıda hücrenin bisülfit mutajenezi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oositleri havuzlamadan, PCR yanlılığı ve kimyasal hücre kontaminasyonu olmadan tek bir oositten veri elde edilebilmesidir. Oosit toplama gününde, yazılı protokolde listelenen solüsyonları taze olarak hazırlayın; solüsyonları hazırlarken eldivenleri sık sık değiştirerek ve filtreli uçlar kullanarak DNA kontaminasyonu riskini azaltın, ayrıca tüpler açıkken ağızlarını dışa doğru eğik tutun ve kullanılmadıkları zamanlarda tüm tüplerin kapağını kapatın.

Diseke edilmiş fare oviduktlarını M two medyumuna yerleştirerek ve cumulus hücre kompleksini çıkarmak için M makarasını çekerek OSI toplama işlemine başlayın. Ardından, 30 µL'lik M two medyumu damlası içerisinde 0,3 mg/mL hyaluronidase çözeltisi kullanarak oositleri cumulus hücre kompleksinden ayırın. Uzun süreli maruziyet oositlere zarar verebileceğinden, oositleri çözelti içerisinde yalnızca cumulus hücrelerini uzaklaştırmaya yetecek süre boyunca tutun.

Oositleri bir damladan diğerine aktararak 30 µL'lik M two medyum damlalarında yıkayın. Toplam üç yıkama boyunca kümülüs hücrelerini periyodik olarak uzaklaştırın. Asidik tyro solüsyonu kullanarak LUCITA'nın Z'sini çıkarın.

Öncelikle oositleri 30 µL'lik bir çözelti damlasına yerleştirin, ardından başka bir 30 µL'lik damlaya aktarın. Beraberinde taşınan herhangi bir besiyeri asidi seyreltecek ve etkinliğini azaltacaktır. Uzun süreli maruziyet hücrelere zarar verebileceğinden, sitleri çözelti içerisinde sadece zona pellucida'yı uzaklaştırmaya yetecek süre boyunca tutun.

Zona kaldırıldıktan sonra, sitleri tekrar 30 µL M2 medyumu damlası içinde yıkayın; agaroz gömmeyi gerçekleştirmek için öncelikle lizis solüsyonunu 70 °C'lik bir ısıtıcı bloğa yerleştirin. Önceden ısıtılmış düşük erime noktalı (LMP) agarozu lizis solüsyonuna ekleyerek, ikiye bir oranında agaroz ve lizis solüsyonu karışımı elde edin. Ardından, tek bir oositi minimal M2 medyumu içinde temiz bir lam üzerine yerleştirin.

Bir sonraki adım, tek hücreyi Agros ve lizis çözeltisine gömmektir. Agros, 65 °C'nin altındaki sıcaklıklarda sertleşeceğinden bu işlem hızlıca yapılmalıdır. Bir mikroskop altında, pipet ucuyla 10 µL Agros lizis çözeltisi alın.

Agros lizis çözeltisinden yaklaşık bir mikrolitre veya daha azını lam üzerine nazikçe boşaltarak minimal besiyeri ile karışmasını sağlayın. Oositi pipet ucuyla nazikçe alın. Ardından, oluşan damlacığın küresel bir şekil alması için tüm 10 mikrolitreyi, 300 mikrolitre mineral yağı içeren bir eppendorf tüpüne aktarın.

Lizis işlemini gerçekleştirmek için tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 300 µL mineral yağı uzaklaştırın ve 500 µL SDS lizis tamponu ekleyin. İkinci gün, örneği 50 °C'ye ayarlanmış bir benmari içinde gece boyunca inkübe edin.

Bi sülfit mutajenez çözeltilerini yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze olarak hazırlayın. Mutajeneze, 500 µL SDS lizis tamponunu tamamen uzaklaştırarak başlayın. Kalan herhangi bir lizis tamponunun, ısıtıldığında agros'u seyrelteceğini ve boncuğun sonraki adımlarda çözünmeye daha yatkın hale geleceğini unutmayın.

Lizis tamponu tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, 300 µL mineral yağ ekleyin. Örneği 90 °C sıcaklıktaki ısıtıcı blokta iki buçuk dakika inkübe edin. Karıştırmak, çalkalamak veya sıcaklığı dalgalandırmak için dikkatli olun.

İki buçuk dakika sonra, örneği 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Denatürasyonu gerçekleştirmek için mineral yağı uzaklaştırın ve tüpe 1 mL 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyip tüpü beş ila altı kez hafifçe vurarak alt üst edin.

Numuneyi 15 dakika boyunca inkübe edin. 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda, her üç ila dört dakikada bir ters çevirerek işlem yapın; boncuk sodyum hidroksit içinde yüzmelidir. Boncuğun artık tüpün dibinde olmadığına dikkat edin.

Sülfit işlemi gerçekleştirmek için, sodyum hidroksit uzaklaştırıldıktan sonra tüpü nazikçe santrifüjleyin. 300 µL mineral yağ ve 500 µL BIS sülfit çözeltisi ekleyin. Işığa maruz kalmamasına dikkat ederek tüpü 50 °C'lik bir su banyosunda üç buçuk saat inkübe edin.

Şimdi destinasyon işlemini gerçekleştirin. Öncelikle, mineral yağı ve BIS sülfit çözeltisini uzaklaştırmadan önce örneği üç dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hafif bir santrifüj sonrası, bir mililitre 0.3 molar sodyum hidroksit ekleyin ve tüpü beş ila altı kez hafifçe vurarak alt üst edin.

Numuneyi 15 dakika boyunca inkübe edin. Her üç ila dört dakikada bir ters çevirerek 37 °C su banyosunda bekletin; PCR işlemine başlamadan önce boncukların sodyum hidroksit içerisinde yüzmesi gerekir. Numuneleri önce hafifçe santrifüj ederek yıkayın.

Ardından sodyum hidroksidi uzaklaştırın ve bir mililitre 1x TE pH 7.5 ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca çalkalayın. İkinci bir hafif santrifüj işleminin ardından, 1x TE'yi uzaklaştırın.

Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Ardından bir mililitre otoklavlanmış, çift distile su ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca çalkalayın, üçüncü kez nazikçe santrifüjleyin ve suyu uzaklaştırın.

Çift distile su ile yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Son olarak, sadece aros boncuğu kalacak şekilde tüm süpernatanı uzaklaştırın. Süpernatanın pH değerinin 5.0 olduğunu kontrol edin.

Süpernatant hâlâ çok bazikse, boncukları çift distile su ile tekrar yıkayın. Bu sırada, yazılı protokolde açıklandığı gibi PCR tüpüne ilk tur PCR karışımını ekleyin. Katı agro hızını einor tüpünün dudağına doğru kaydırın.

Ardından, agro speed'i dikkatlice PCR tüpüne aktarın, bir dakika boyunca 70 °C'de ısıtın ve karıştırın; ardından yazılı protokolde önerilen amplifikasyonu gerçekleştirin. İlk tur amplifikasyonun ardından, ilk tur ürününün 5 µL'sini kalıp olarak kullanarak ikinci tur PCR reaksiyonunu hazırlayın. Pipet ucunun mineral yağı tabakasının altında olduğundan emin olun.

Tanı testi olarak, metinde belirtildiği şekilde ikinci amplifikasyon turunu gerçekleştirin. İkinci tur örnekleri, metilasyon veya suş spesifik bir restriksiyon enzimi ile kesilebilir ve sindirim ürünleri %8 akrilamid jelde elektroforezle analiz edilebilir. Ortaya çıkan heterojen bantlar birden fazla diziyi temsil eder; ikinci tur ürününü klonlamak için vektöre ligasyon yapın ve bu videoya eşlik eden makalede açıklandığı şekilde TA klonlama işlemini gerçekleştirin. TA klonlamayı takiben, tüm reaksiyon karışımını ampisilin, X-gal ve IPTG ile desteklenmiş bir LB agar plağına yayın ve plağı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ardından, yazılı protokolde belirtildiği şekilde koloni PCR master mix'ini PCR tüpüne ekleyin. Plakadan pipet ucuyla beyaz bir bakteri kolonisi alın ve bunu bir PCR tüpündeki 35 µL koloni PCR master mix'i içerisinde döndürerek karıştırın. Süspansiyonun amplifikasyonuna devam edin; PCR amplifikasyonunu takiben, PCR ürününün 4 µL'sini %1,5 AGROS jel üzerinde elektroforez ile analiz edin.

Son olarak, her bir hücre başına beş koloni PCR'ı için yaklaşık 30 µL PCR ürününü sekanslamaya gönderin. Sekanslama sonuçları elde edildiğinde, metilasyon modelleri okunabilir; orijinal haliyle kalan her sitozin guanin metillenmiştir. Aksine, bisülfit ile dönüştürülmüş primerler kullanılarak yapılan nested PCR amplifikasyonu sonrası timin guaninine dönüşen her orijinal sitozin guanin metillenmemiştir.

Bir agaroz jel üzerindeki bireysel metafazda doğru fragman boyutunun görselleştirilmesiyle başarılı bir dönüşümün doğrulanması mümkündür. İki oosit bir ebeveyn alelini temsil eder ve teorik olarak buna bağlı olarak tek bir baskılanmış (imprinted) metilasyon paternine sahiptir. İkinci tur PCR ürünleri, istenmeyen kontaminasyon açısından test edilebilir.

DNA metilasyonuna duyarlı bir restriksiyon enzimi, ikinci tur PCR ürününü sindirmek ve metillenmiş veya metillenmemiş bir alel içerip içermediğini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, enzim tanıma dizisi içindeki metillenmiş bir sitozin kesilir. Timine dönüştürülmüş metillenmemiş bir sitozin artık enzim tarafından tanınmaz ve kesilmez; ancak hem metillenmiş hem de metillenmemiş aleller içeren herhangi bir metafaz iki oosit örneği, ligasyon ve transformasyon sonrası kumulus hücresi kontaminasyonunun veya polar cisim dahil edilmesinin göstergesi olduğundan atılmalıdır.

Başarılı koloni PCR amplifikasyonu, doğru ürün boyutuna sahip örneklerin dizilemeye gönderildiğinden emin olmak için AROS jelinde görselleştirilebilir. Bu örnek için, ligasyon sonrası beklenen amplikon boyutu 56 baz çiftidir. Burada, klon beş yanlış bir amplikon boyutuna sahiptir ve dizilemeye gönderilmemelidir.

Metafaz iki oositinden elde edilen beş ayrı klonun sekansı, beş özdeş metilasyon paterni ve özdeş non-CPG konversiyon oranları üretmelidir. Birden fazla patern içeren tüm örnekler elenmelidir. Ovüle olmuş metafaz iki oositleri iki kromozom kopyasına veya yapışık bir polar cisme sahip olduğundan, iki benzer sekans paterni elde edilme olasılığı vardır.

Çok farklı metilasyon modellerine sahip olan tüm sitlerden gelen veriler atılmalıdır. Bu prosedür uygulanırken kumulus hücresi kontaminasyonu dışlanamadığından, öncelikle HI IDE işlemini takiben, mümkün olduğunca çok kumulus hücresini uzaklaştırmak için oositlerin taze ortamda defalarca yıkanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. İkinci olarak, düşük erime noktalı agaroz 65 °C'nin altındaki sıcaklıklarda sertleşecektir, bu nedenle dikkatli ancak hızlı çalışın.

Son olarak, sodyum bisülfat ve hidrokinon ışığa duyarlıdır, bu nedenle reaksiyon tüpleri ve çözeltiler folyo ile sarılmalıdır.