Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel beta hücre kütlesindeki değişimleri düzenleyen sinyal yollarını belirlemektir. Bu işlem, adenoviral vektörler kullanılarak bir genin aşırı eksprese edilmesi veya ekspresyonunun baskılanması yoluyla izole sıçan adacıklarında gerçekleştirilir. Bu manipülasyondan sonra, beta hücresi fonksiyonu insülin sekresyonu ile, adacık replikasyonu ise tritiyumlu timidin inkorporasyonu ile ölçülerek değerlendirilir.

Nihayetinde, bu analizler, ilgilenilen bir genin in vitro ortamda beta hücresi proliferasyonunu ve/veya fonksiyonunu düzenleyip düzenlemediğini gösterebilir. Bu yöntem, bir sinyal yolunun belirli bir bileşeninin beta hücresi büyümesini ve fonksiyonunu etkileyip etkilemediği gibi, göz kapağı biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Gerekli sayıdaki kuyucuğa iki mililitre modifiye medyum ekleyerek, doku kültürü kaplamasız altı kuyucuklu bir plaka hazırlayın.

Örneğin, tipik bir deney; bir virüssüz kontrol, bir virüs kontrolü ve bir deneysel grup için birer tane olmak üzere üç kuyucuk gerektirebilir; plakayı bir doku kültürü inkübatöründe en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın. Sıçan gözlet izolasyonunun hemen ardından, hazırlanan plakanın her bir kuyucuğuna 1 ila 200 gözlet yerleştirin. 60 gözlet biyokimyasal analizler için kullanılacak, geri kalan gözletler ise gen ekspresyon çalışmaları veya immünoblotlama için kullanılabilir; gözletleri her birinin merkezine getirmek için plakayı hafifçe sallayın.

Ardından, adenovirüsü hemen tabağın merkezindeki gözlelerin üzerine doğrudan pipetleyin. İlgilendiğiniz proteinin aşırı ekspresyonu veya susturulmasındaki etkinliğine bağlı olarak, 1 ila 500 enfeksiyon multiplicities (MOI) değerlerini kullanın.

Adenoviral penetrasyonun göz kapağının merkezine verimli bir şekilde gerçekleşmesi, sonuçların tutarlılığını artırır. Göz kapaklarının, izolasyonun hemen ardından transdüse edilmesi esastır.

Plakayı beş dakika boyunca rahatsız etmeyin, ardından 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, plağı inkübatörden çıkarın ve eyeletleri nazikçe kuyucukların merkezlerine doğru şişirin. Eyeletleri, 200 µL'lik bir mikropipet kullanarak taze besiyeri içeren yeni bir kuyucuğa aktarın.

Kuşgözleri plakaya yapışırsa, pipet ucuyla nazikçe yerinden çıkarılabilirler. Adenovirüsün adacık çekirdek kültürüne nüfuzunu görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanarak, yeterli transdüksiyon verimliliğini doğrulamak amacıyla GFP eksprese eden bir kontrol virüsü kullanmak faydalıdır. Besiyerini günlük olarak değiştirerek adacıkları bir ila üç gün daha bekletin.

Kültür süresi pilot çalışmalarla optimize edilmelidir ve deneysel hedeflere göre değişiklik gösterir. Son 24 saat için, medyuma mililitre başına bir mikro curie konsantrasyonunda trityumlanmış timidid ekleyin. İlk olarak, 50 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 50 mililitre taze çalışma SAB'si hazırlayın ve bunu 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.

15 mL'lik konik tüpe 10 mL çalışma SAB'si pipetleyin ve 66,8 µL 2,5 M D glikoz ekleyin. Yüksek glikozlu SAB hazırlamak için, geri kalan 40 mL çalışma SAB'sine 44,8 µL 2,5 M D glikoz ekleyin. Düşük glikozlu SAB hazırlamak için, ardından üç adet 1,7 mL'lik mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.

Altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğu için her tüpe bir mililitre PBS ekleyin. Radyoaktif gözlemlerin taşınması ve bertarafı ile ilgili kurumsal protokollere uymayı unutmayın. Bir stereoskop veya standart mikroskop kullanarak, benzer boyutlardaki 20 gözlemi seçin ve her bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Örneğin, her tüp beş küçük, 10 orta ve beş büyük boyutlu göz halkası içerebilir. Sonuçlar deney sonunda toplam protein içeriğine göre normalize edilse de, gruplar arasındaki göz halkalarının boyutlarının eşleştirilmesi kritiktir. Göz halkalarının yerçekimiyle veya santrifüjle tüpün dibine çökmesine izin verdikten sonra, PBS'yi bir mikro pipetle aspire edip tartın ve ardından göz halkalarını biyokimyasal analizler için hazırlama aşamasına geçin.

İnsülin sekresyon analizi için ayletleri hazırlamak amacıyla, öncelikle düşük glukozlu SAB ile ön inkübasyona tabi tutulmalıdırlar. Bunun için, tüplere 400 µL düşük glukozlu SAB ekleyin ve kapakları kapalı şekilde doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. 60 dakika sonra, ön inkübasyon için kullanılan düşük glukozlu SAB'yi aspire ederek uzaklaştırın. Bazal insülin sekresyonunu ölçmek için ön inkübasyon prosedürünü tekrarlayın.

Buna karşılık, stimüle edilmiş insülin salınımını ölçmek için düşük glukozlu SAB yerine 400 microliters yüksek glukozlu SAB kullanın ve daha önce olduğu gibi, adacıkları yüksek veya düşük glukozlu SAB'da inkübe ettikten sonra 60 dakika boyunca inkübe edin; ardından üretici protokolüne göre gerçekleştirilecek olan insülin radyo immünolojik testi için SAB'yi aspire edin. Daha sonra, aynı adacık grubuyla timidin inklüzyon analizine geçin. İnsülin salınım analizi için yeni kullanılmış olan adacıklarla başlayın.

Bir mililitre PBS ekleyin ve gözletlerin yerçekimi ile çökmesini bekleyin. Ardından PBS'yi bir mikro pipetle aspire edin. Atın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın.

Ardından, gözilmeklerine 500 µL buz soğukluğunda trikloroasetik asit ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Tüpleri 4 °C'de santrifüjleyin. Daha sonra aspirasyon yoluyla TCA'yı uzaklaştırın.

Ardından, 80 µL 0,3 normal sodyum hidroksit ekleyin ve gözlemleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, her 10 dakikada bir örnekleri 5 ila 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Paralel olarak, yedi mililitrelik sıvı sintilasyon sayım tüplerine dört mililitre conno safe sayım kokteyli ekleyin.

Gözlerin inkübasyonu tamamlandığında, gözlerden 50 µL'yi bir sintilasyon tüpüne ekleyin. Kapağı kapalı tüpü kısa süreliğine çalkalayın ve örneklerin radyoaktivitesini bir sıvı sintilasyon sayacında ölçün. Ayrıca protein konsantrasyonunu ölçmek için, viallerden 10 µL'yi ticari bir bionic asit assay kitine aktarın ve üreticinin protokolünü izleyin.

Daha sonra veri analizi sırasında, tanımlanan protokolleri kullanarak sonuçları protein konsantrasyonuna göre normalize edin. Adacık replikasyonu ve beta hücresi fonksiyonu. Sıçanlarda yapılan değerlendirmelerde, hipotetik gen altısının adenoviral aşırı ifadesinin, beta hücresi fonksiyonunu değiştirmeden adacık replikasyonunu güçlü bir şekilde stimüle ettiği görülmüştür.

Sıçan gözlemlerindeki hücrelerin çoğu beta hücresi olduğu için, gen altı'nın artan ekspresyonu, timidinin inklüzyonu ile ölçüldüğü üzere artan DNA sentezi ile sonuçlanmıştır. İleri deneyler, timidinin inklüzyonundaki bu artışın beta hücresi replikasyonundaki bir artıştan kaynaklandığını gösterebilir. İnsülin sekresyon analizi, gen altı'nın aşırı ekspresyonunun, temel beta hücresi fonksiyonlarından biri olan düşük ve yüksek glukoz seviyelerindeki insülin sekresyonunu değiştirmediğini kanıtlamıştır.

Düşük ve yüksek glikoz konsantrasyonlarında insülin sekresyonundaki artış, adenovirüs tedavisi sonrası adacıkların sağlık durumunu yansıtır. Eğer gen altı ekspresyonunun artırılması beta hücre fonksiyonunu bozsaydı, bu durum muhtemelen yüksek stimüle edici glikoz konsantrasyonlarında salgılanan insülinin azalması şeklinde kendini gösterirdi. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir genin beta hücresi büyümesini veya fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için beta hücresi replikasyonunun ve insülin sekresyonunun nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olacaksınız.