Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Tükürük peptidlerini inceleyen bu çalışmada, lolipop benzeri bir ultrafiltrasyon probu ve ardından doğrudan nano LC LT Q kütle spektrometrisi analizi kullanılmaktadır. İlk olarak, bir polieter sülfon membran ve bir etilen propilen tüp kullanarak LLUF probunu monte edin. Ardından, gönüllülerden tükürük örnekleri toplayın ve tükürükten örnekleme yapmak için bu örnekleri LLUF probundan geçirin.

Ardından doğrudan nano L-C-L-T-Q kütle spektrometresine geçiniz ve LLUF prob işlemi uygulanmış ve uygulanmamış tükürük örneklerinden elde edilen verileri analiz ediniz. Nihayetinde, L-C-M-S-S verileri analiz edilerek ve iki örnek arasında tanımlanan peptitler karşılaştırılarak tükürük peptidi elde edilebilir. Doğrudan nano lc LTQ kütle spektrometresi analizine bağlı, lolipop benzeri bir ultrafiltrasyon probu kullanan bu yaklaşım, tükürük proteinlerinin peptitlere sindirilmesi gibi diğer yöntemlere göre temel avantajlar sunmaktadır.

Kütle spektrometrisi analizini takiben LUF PRO, klinik uygulama için tüm tükürükteki peptitlerin MS tespitini kolaylaştırıp temizler ve aynı zamanda artırır. Epoksi yapıştırıcı kullanarak polieter hücre telefonu membranlarını üçgen polipropilen küreklerin kenarlarına mühürleyin. Ardından, bir Teflon florlanmış etilen propilen tüpü bir üçgenin silindir çıkışına takın.

Polipropilen kürek; sızdırmazlığın uygunluğunu değerlendirmek için probları %70 alkol ile gece boyunca sterilize edin, LLUF problarını iki saat boyunca 50 mg/mL mavi dekstran çözeltisine daldırın. Toplanan numunelerde mavi dekstran bulunmadığını doğrulayın.

20 ile 40 yaş arası sağlıklı gönüllüler belirleyin. Su ile ağız çalkalamasının ardından, denekten tüm tükürük örneklerini buzla soğutulmuş bir kaba tükürmesini isteyin. Tüm örnekleri birleştirin ve buz üzerinde saklayın.

Toplamanın hemen ardından, LLUF probları ile örnekleme yapmak için 200 µL tükürük ile 4 °C sıcaklıktaki bir odaya geçiniz. Şimdi, bir kültür kabındaki insan tükürüğüne polieter hücre telefonu membranını batırınız. Tükürükten örnekleme yapmak amacıyla ultrafiltrasyon işlemini simüle etmek için bir şırıngayı geri çekerek negatif basınç oluşturunuz.

Ardından, protein konsantrasyonlarını belirleyin. Nano LC kütle spektrometrisi analizi için tükürük protein örneklerini mikrolitre başına bir mikrogram olacak şekilde hazırlayın. Örnek analizi için, Finnegan LTQ kütle spektrometresi ile çevrimiçi olarak eşleştirilmiş bir Exigent nano LC kullanıyoruz. İlk olarak, sindirilmemiş tükürük örneklerinden beş mikrolitreyi otomatik örnekleyici aracılığıyla nano LC sisteminin tuzak kolonuna yükleyin.

Yıkama adımının ardından valfi değiştirin ve tuzağa ve C 18 ayırma kolonuna %0'dan %50'ye doğrusal bir tampon B gradyanı uygulayın. Excalibur'un veri bağımlı (data dependent) modunu kullanarak, 1x10⁴ yoğunluğun üzerindeki en güçlü dört MS iyonunun ms/ms spektrumlarını toplayın. Her örnek için, üç farklı ayrı hazırlığın çift çalışmasını gerçekleştirin.

Ardından veri dosyasını Sequester Sorcerer 2 sistemine aktarın; enzim özgüllüğü kullanmadan, uygun bir insan NCBI protein veri tabanında arama yapacak şekilde seçimi gerçekleştirin. Sequester araması tamamlandıktan sonra sonuçlar otomatik olarak filtrelenir, doğrulanır ve Sequester sonuçlarına dayanarak peptid profili ve protein profili şeklinde görüntülenir. Peptid profili, bir peptid atamasının yanlış olmasına kıyasla doğru olma olasılığına dair kapsamlı bir P skoru tahmin eder ve ayrıca her bir peptid dizisi hakkında ek bilgiler tanımlar.

Protein profit, Ms.Ms Spektralara atanan peptidlerin temelinde her bir protein için sıfırdan bire kadar bir olasılık skoru hesaplar. Bu bölüm, bakteriyel tespit kültürü için LLUF problarının oral bakterileri uzaklaştırma kapasitesini belirler; aerobik bakteri testi için LLUF prob toplama öncesi ve sonrası tükürük örnekleri agar plakalara ekilir. Bir gün boyunca 37 °C'de antibiyotiksiz LB agar plakaları kullanın ve anaerobik bakteriler için kültürleme işleminde gaz paketi kullanın.

Örnek, anaerobik koşullar altında 37 °C'de bir gün boyunca BHI besiyeri ve agar plaklarında inkübe edilir. Lolipop benzeri ultrafiltrasyon cihazlarının imalatı, taklit edilmiş bir oral ortamda tükürük örneklemesini kolaylaştırır. Bu sistemde, 30 kilodalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip negatif yüklü bir polieter sülfon membran, bir polipropilen pede yapıştırılır ve tükürükteki daha büyük proteinleri filtrelemek için LLUF probunun önüne yerleştirilir.

İnsan ağız ortamını taklit etmek amacıyla, bir sünger şırınga kullanılarak tükürüğe batırılır. Tükürük filtrelenir ve bağlı tüp aracılığıyla toplanır. LLUF örneklemesi öncesi ve sonrası tükürüklerin lc kromatogramlarının karşılaştırılması, nano L-C-L-T-Q kütle spektrometrisi ile yerli tükürük peptidlerinin tanımlanmasını sağlamıştır.

Bu diferansiyel kromatogramlar kimyasal veya enzimatik sindirim olmadan elde edildiğinden, klinik amaçlar için numune hazırlama sürecini basitleştirirler. Bu numunede, farklı protein kompozisyonlarının LLUF ile aydınlatılmasının ardından sindirilmemiş tükürükte 131 peptid tanımlanmıştır.

Bu peptitler, çeşitli prolin bakımından zengin proteinlerden türetilmiş fragmanlardır. Aktin alfa amilaz alfa bir globin beta globin, his sustain bir keratin, bir müsin yedi polimerik immünglobulin reseptörü serin ve S 100. LLUF probları ile filtreleme sonrası tükürükte tanımlanan 26 benzersiz peptit, temel olarak çeşitli prolin bakımından zengin proteinlerden türetilmiş fragmanlardır.

Alfa amilazdan türetilen bu peptit, LLUF probları ile toplama yapılmayan bir tükürük örneğinde münhasıran tespit edilmiş olup, bu durum LLUF problarının büyük proteinleri uzaklaştırma kapasitesini göstermektedir. En ilgi çekici olanı, büyük proteinler uzaklaştırıldıktan sonra LLUF probu ile örneklenen tükürükte birçok sekans peptidi tespit edilebilmiş; özellikle ultrafiltrasyon LLUF problarından sonraki örneklerde prolin açısından zengin C-terminallere sahip peptidler tanımlanmıştır. Artık kütle spektrometrisi için basit tükürük örneklerinde A-L-L-L-L-U-F PRO'nun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Tutarlı koşullar altında basit tükürük örnekleri toplamak için daha iyi bir analiz çok önemlidir. Bu teknik bir kez kavrandığında, üç saat içerisinde uygun şekilde gerçekleştirilebileceğine inanıyorum. Lolipop benzeri ultrafiltrasyon probunun doğrudan nano L-C-L-T-Q-M-S, spektrum zincir analizi ile birleştirildiği bu yaklaşım, insan hastalıklarının teşhisinde biyobelirteçlerin klinik uygulamalarını kolaylaştırmaktadır.