Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Bu standart teknik, kantitatif invadopod matriks degradasyonu analizleri için uygun olan, floresan işaretli jelatin kaplı lameller üretir. Lamelleri floresan işaretli jelatin ile kapladıktan sonra, hücreleri ekimleyin ve matriks degradasyonu için kültüre edin. Ardından, invadopod belirteç proteinleri için hücreleri fikse edin ve floresanla boyayın; görüntüleri elde edin ve matriks degradasyonunu nicelleştirin.

Tipik sonuçlar, seçili genlerin farklı manipülasyonuna sahip hücreler veya farmakolojik ajanlarla tedavi edilen hücreler arasında, inve podia aracılı matris degradasyonundaki farkları nicelleştirebilir. Florasan jelatinin düzensiz kaplanması veya jelatin kaplı lamel ile ilgili hatalı işlemler nedeniyle, homojen florasan özellikli jelatin kaplı lameller hazırlamanın zor olması sebebiyle bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü araştırma yardımcı profesörü Karen Martin, doktora sonrası araştırmacı Mandy Ammer ve lisansüstü öğrenciler Elise Walk, Karen Hayes ve Steve Markwell sunacaktır.

Etiketsiz %5 jelatin sakkaroz stok çözeltisini hazırlamak için, jelatin ve sakkarozu PBS içerisinde birleştirin ve 37 °C'de tamamen çözünmesini sağlayın. Ardından 4 °C'de saklayın. Cam lamel temizleme işlemine geçin.

24 kuyucuklu plastik bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna bir adet lamel yerleştirin, her kuyucuğa 500 µL %20 nitrik asit ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Nitrik asit çözeltisini uzaklaştırdıktan sonra, lamelleri deiyonize su ile üç kez yıkayın. Ardından kaplama işlemine geçin.

Her bir lamelin üzerine 50 µg/mL poly-L-lisin çözeltisinden 500 µL ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Poly-L-lisin çözeltisini uzaklaştırın ve PBS ile üç kez yıkayın. Poly-L-lisin kaplama, üzerine eklenecek işaretli jelatinin eşit şekilde kaplanmasını ve bağlanmasını kolaylaştırır. 24 kuyucuklu plakaları buz üzerine yerleştirin ve her birine taze hazırlanmış 0,5% glutaraldehitten 500 µL ekleyin.

Plakaları 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Soğuk PBS ile üç kez yıkama yapın ve ardından jelatin kaplama işleminden önce tüm PBS kalıntılarını aspire edin. Bu sırada, glutaraldehit inkübasyonu gerçekleşirken Oregon Green 488 konjuge jelatini yeniden çözün.

Üreticinin protokolüne uygun olarak, bunu ve etiketsiz %5 jelatin sükroz stok çözeltisini 37 °C'ye ısıtın. Ardından, 500 µL etiketli jelatini dört mL etiketsiz jelatine seyreltin. Seyreltilmiş 4 88 jelatin karışımından 100 µL'yi her bir lamelin üzerine pipetleyin.

Manuel yayma işlemi yapmadan lamelin tamamını kaplayacak kadar jelatin kullanın. Erken katılaşmayı önlemek için kaplama prosedürü sırasında seyreltilmiş 4 88 jelatin karışımının 37 °C'de tutulması önemlidir. Ayrıca, olası fotobezmeyi önlemek için bu adımdan itibaren lamelleri mümkün olduğunca karanlıkta tutun.

Tüm lameller tek bir plakada kaplandığında, plakayı eğik tutun ve vakum aspirasyonu ile her kuyucuktaki fazla jelatini uzaklaştırın. Ardından, kaplanmış lamelleri oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamelleri üç kez PBS ile yıkadıktan sonra 500 µL sodyum borohidrür ekleyin.

Hidrür efervesan bir yapıdadır ve her bir lamelin üzerinde ve çevresinde küçük kabarcıklar belirginleşecektir; kalıntı glutaraldehidi indirgemek ve inaktive etmek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Sodyum borohidrür çözeltisini, her bir kuyucuğun dış çevresinde hızlı bir süpürme hareketiyle vakumlu aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Sodyum borohidrür işlemi sırasında doku kültürü plağının tabanından ayrılmış olan yüzer lamelleri çekmemeye dikkat edin. Üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, lamelleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %70 etanol içinde inkübe edin.

Steril teknik kullanarak, plakları içeren lamelleri tip iki bir B hücresi kültür laminer akışlı kabine aktarın ve steril bir iğne ile pens yardımıyla lamelleri üç kez steril PBS ile durulayın. Lamelleri dikkatlice yeni bir 24 kuyucuklu plakanın boş bir kuyucuğuna aktarın ve lamelleri, kullanılacak spesifik hücre tipi için hazırlanan kültür ortamı ile dengeleyin.

Uygun bir inkübasyon süresinin ardından hücreleri doğrudan lamel üzerine ekleyin. Örnekleri monte etmek için immünofloresan görüntüleme işlemlerini gerçekleştirin. Bir mikroskop lamı üzerine bir damla prolonged gold anti fade veya benzeri bir reaktif yerleştirin ve ters çevrilmiş lameli dikkatlice konumlandırarak analiz için görüntüler elde edin.

Bu analiz, hücre alanına veya hücre sayısına oranla normalize edilmiş matris degradasyon alanını sağlar. Birden fazla hücrenin bulunduğu ve toplu olarak irna büyüme faktörleri veya terapötik ajanlarla işleme tabi tutulduğu tüm mikroskobik görüş alanlarının analiz edilmesi için kullanışlıdır. Bu analiz için, hücre popülasyonları hakkında verimli bilgi toplamak için yeterli olan düşük büyütmede toplanmış görüntüler kullanılır.

Görüntüyü Image J programında açın. Ölçek bilgilerini kontrol edin ve ölçümleri seçin. Alan ve eşik değerine sınırlama seçeneklerini belirleyin. Jelatin üzerindeki düzensiz aydınlatmayı, arka plan eşiğini çıkararak düzelten floresan jelatin görüntüsünü kullanarak degradasyon alanını hesaplayın; üst ve alt piksel yoğunluk değerlerini belirlemek için görüntüyü kullanın.

Sonraki görüntülerde, degradasyon alanlarını seçmek için objektif bir yöntem olarak, eşik penceresindeki ayarla (set) düğmesini kullanarak tüm görüntüler için aynı eşiği belirleyin. Matriks degradasyonu olan alanlardaki eşik değerini ölçmek için parçacıkları analiz et (analyze particles) işlevini kullanın.

Seçimdeki gürültüleri gidermek için sıfırdan büyük bir parçacık boyutu seçin. İlgi bölgelerini belirlemek için ana hatları gösterin. Ardından, çizim tüm deformasyon alanlarını özel olarak belirlediyse, ölçümleri görmek için sonuçları görüntüle ve özetle seçeneklerini işaretleyin.

Eğer kalıntı gibi diğer nesneler seçilmişse, toplam alan ölçümünü bir hesap tablosuna kopyalayın ve yalnızca ilgili ilgi bölgelerinin alanlarını kaydedin. Ardından hücre alanını hesaplamak için, sonraki görüntülerde hücre kenarlarının seçilebilmesi amacıyla üst ve alt piksel yoğunluk değerlerini ayarlamak için görüntünün eşik değerini açın. Tüm görüntüler için aynı eşik değerini ayarlamak için eşik penceresindeki set düğmesini kullanın.

Hücre alanını seçmek için objektif bir yöntem olarak, hücrelerin alan eşiğini ölçmek için parçacıkları analiz et (analyze particles) işlevini kullanın. Seçimdeki gürültüyü gidermek için sıfırdan büyük bir parçacık boyutu seçin.

Analiz edilecek bölgeleri belirlemek için ana hatları gösterin, görüntüleme sonuçlarını kontrol edin ve alan ölçümlerini göstermek için özetleyin. Kontrol etmeyin. Hücreler ile bir küme arasında boşluklar varsa delikleri dahil edin.

Şimdi seçim yapın. İlgili ilgi alanlarının alan sonuçlarını bir hesap tablosuna kopyalayın ve toplam hücre alanına oranla jelatin degradasyon alanını hesaplayın. Alternatif bir yaklaşım ise, DAPI boyalı çekirdekleri sayarak belirlenen hücre sayısına göre degradasyon alanını normalize etmektir.

Manipülasyonlar ortalama hücre alanını değiştiriyorsa bu durum önem taşır. Bu yaklaşım için, çekirdekleri otomatik olarak saymak amacıyla nucleus counter eklentisini kullanın. Seçenekleri kendi görüntüleriniz için optimize edecek şekilde ayarlayın. Çekirdekler çok fazla örtüşüyorsa, bu durumda otomatik sayım doğru bir numaralandırma sağlamayabilir.

Doğru şekilde uygulandığında, hücre sayıcı eklentisi kullanılarak manuel sayım kolaylaştırılabilir. Lamelcikler, Oregon Green 488 konjuge jelatin ile eşit şekilde kaplanır. Jelatin kaplı lamelciklerin kaplama ve işleme süreçleri sırasında çeşitli artefaktlar meydana gelebilir.

Örneğin, yetersiz karıştırma, manuel yayma veya jelatin karışımının kısmi katılaşması nedeniyle kaplama işlemi sırasında lamelin uygun şekilde örtülmemesi düzensiz kaplama ile sonuçlanır. Kazınmalar, taşıma sırasında iğne veya pensetle çizilme sonucunda kaplanmış matrisin uzaklaştırıldığını gösterir. Uzun süreli saklama dönemlerinde lamel yüzeyinin kuruması, arnavut kaldırımı görünümüne yol açabilir. Bu alan, görüntüleme sırasında uzun süreli veya yüksek yoğunluklu ışık maruziyeti nedeniyle floresan jelatin yüzeyinin fotobeyazlamasını yansıtmaktadır.

İyi hazırlanmış bir lamelin mikroskopi ile görüntülendiğinde homojen floresans sergilediğine dikkat edin. Bu prosedür sırasında üretilen ince matrisler, hücrelerin ECM'yi degrade etme yeteneğini değerlendirmek için hassas bir araç sağlar. Örneğin.

Bu görüntüler, bir OSC 19 baş ve boyun kanseri hücresinin invaziv podium matris degradasyon aktivitesini yakalamaktadır. Burada hücreler, Oregon Green 488 konjuge jelatin kaplı lam üzerine ekilmiş ve hem 2D hem de 3D görüntülerle gösterildiği üzere floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. Oregon Green 488 konjuge jelatin lamlar üzerine ekilen bu OSC 19 hücreleri, R-domine konjuge Phalloidin ve anti-kortaktin antikorları ile işaretlenmiş, ANOR 647 sekonder antikoru ile görselleştirilmiş ve invaze bölgeler yalancı renklendirme ile yeşil olarak gösterilmiştir.

Birleştirilmiş görüntüde podia, gelatin clearing volume fill alanlarıyla örtüşen F actin ve cortan'ın fokal sitoplazmik konsantrasyonları olarak belirgindir. Görselleştirme, invaze podiaların ECMA alt hacmine nasıl nüfuz ettiğini tasvir etmektedir; hücre içinde invaze podiaların bulunduğu bir kenarı göstermek için alt hacim oluşturulmuştur. Dorsal kenar görünümü, alttaki jelatine yerleşmiş invaze podiaları göstermektedir.

Ventral kenar görünümü, Veda podialarında protrusions ve lamelli altındaki jelatin bozunma alanlarını, yeşil matris içerisinde kırmızı bölgeler olarak göstermektedir. Bu görüntüler, tüm mikroskobik görüntü içerisindeki normalize edilmiş jelatin matrisi bozunma hücrelerinin miktar tayini için bazı önemli adımları göstermektedir. Kırmızı eşikleme ve ilgi alanı işaretlemelerini daha iyi sergilemek için tüm floresan görüntüler gri tonlamaya dönüştürülmüştür.

Oregon Green 488 konjuge jelatinin bu görüntüsü, bozunmanın meydana geldiği koyu alanları göstermektedir. Eşikleme ile jelatin görüntüsü, bozunma alanlarını belirginleştirir ve bu alanlardan seçilen ilgi bölgeleri, bozunma alanı açısından ölçülür. Bu görüntü; beklenildiği üzere rumine, foid ve f aktin boyamasını göstermektedir.

Aktin görüntüsündeki eşikleme, ölçülecek hücre alanlarının seçildiği toplam hücre alanını vurgular. Benzer şekilde, bu teknik DAPI ile boyanmış hücre çekirdeklerinin görüntülerini incelemek için de uygulanabilir. Bu panel, karma bir hücresel popülasyon içindeki münferit hücreler tarafından gerçekleştirilen floresan jelatin yıkımının miktar tayini ile ilgili seçilmiş adımları göstermektedir.

Bu basit nicelleştirme, flag epitop etiketi ile birleştirilmiş rekombinant kort aktin aşırı eksprese eden tek bir transfekte OSC 19 hücresine aittir. Transfekte hücreler tarafından gerçekleştirilen matriks degradasyonunun, transfekte ve transfekte edilmemiş hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon içinde de nasıl analiz edilebileceğine dikkat edin. Bu prosedürü uygularken birkaç noktayı hatırlamak önemlidir.

Öncelikle, floresan hücre belirteçlerinizin floresan jelatinin rengiyle örtüşmediğinden emin olun. Görüntüler toplanırken, alanların hücre varlığına göre seçilmesi önemlidir. Hücre hatları arasındaki değişkenlik ve çeşitli terapötik ajanlara verilen yanıtlar nedeniyle verilerde sapmaya yol açabileceği için, öncelikli olarak dejenerasyon alanları aramayın.

Koltuk sayısı, degradasyon süresi ve immünofloresan etiketleme için protein seçimi gibi faktörler, sizin özel deneyiniz için optimize edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, beta podia aracılı degradasyon deneylerinden floresan jelatin ile homojen şekilde kaplanmış lamellerin nasıl hazırlanacağı ve matris degradasyonunun kantifikasyon yöntemleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.