Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Bu prosedürün amacı, döngüsel B'nin proteolizinin anafaz başlangıcını ve mitotik çıkışı nasıl yönettiğini izlemektir. Bu işlem, öncelikle döngüsel B snap raporcu hücrelerin mikroskopi lamlarına ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kimerik Cyclin B snap raporcu molekülün floresan substrat TMR star ile işaretlenmesidir.

Ardından, görüntü serileri bir mikroskopi istasyonunda elde edilir. Son adım, hücrelerin analiz edilmesi ve cycling B proteolizini yansıtan TMR star floresans yoğunluğunun zaman içindeki değişiminin hesaplanmasıdır. Nihayetinde, canlı raporcu hücrelerin immunofloresans mikroskopisi, mitoz sırasında gerçekleşen cycling B proteolizinin kinetiğini ortaya koyar.

Bu tekniğin siklon BGFP izleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, siklon B SNAP'in tüm protein ekspresyonu yerine siklon B degradasyonunun izlenmesine olanak tanımasıdır. Bu deney için kullanılan snap reporter hücrelerinin başlangıçta log fazında en az 48 saat boyunca asenkron olarak büyümesine izin verilir. Başlangıç olarak, trypsin ekimi prosedürü, sekiz kuyucuklu mikroskop odacıklarına hücre ekimi için sub-konfluens snap reporter hücrelerin, odacık santrifüjünün tüm yüzeyine sabit bir dağılımla yerleştirilmesini içerir.

10.000 hücre ve Resus, 350 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında süspanse edilir. Hücrelerin sekiz kuyucuklu mikroskop odacıklarına, odacığın merkezinde maksimum hücre yoğunluğu olacak şekilde ekilmesi için hücre süspansiyonu mikroskop odacığına aktarılır. İlk olarak odacık, 300 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı ile doldurulur.

Ardından, hücrelerin 96 kuyucuklu özel optik plakalara, kuyucuk yüzeyinin tamamına sabit bir dağılım sağlayacak şekilde ekilmesi için mikroskop odasının merkezine dikkatlice 5.000 hücre ekleyin; gerekli olan hücre içeren toplam kuyucuk sayısına bağlı olarak 5.000 hücreyi santrifüjleyin ve 300 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamında yeniden süspande edin. Hücre sayısını ve süspansiyon ortamının toplam hacmini ayarlayın.

Ardından, hücrelerin kuyucuk merkezlerinde maksimum hücre yoğunluğuna sahip olacak şekilde 96 kuyucuklu özel optik plaklara ekilmesi için hücre süspansiyonunu 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Her bir kuyucuğun merkezine, 15 µL fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı içerisinde 1.500 hücreyi küçük bir damla halinde dikkatlice ekleyin.

Bu işlem, hücre büyümesini kuyucuğun merkeziyle sınırlandıracaktır. Boyama prosedürünün başlamasından 30 dakika önce, ekilen tüm hücrelerin standart hücre kültürü koşulları altında en az 18 saat boyunca büyümesine izin verin. Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı miktarlarını 37 °C'ye ısıtın.

Bu gösterimdeki snap substratı, kolay kullanım için TMR star'dır; 400 micromolar konsantrasyonda bir stok çözelti elde etmek için TMR star'ı DMSO içinde çözün; ardından, bir micromolar final etiketleme konsantrasyonuna ulaşmak için 0,5 microliters TMR star stok çözeltisini 200 microliters ılık fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyerinde seyreltin. Daha sonra, asenkron olarak büyüyen hücrelerdeki normal büyüme besiyerini uzaklaştırın ve yerine etiketleme besiyeri ekleyin; hücreleri standart kültür koşulları altında etiketleme besiyerinde 25 dakika boyunca inkübe edin.

25 dakika sonra, işaretleme besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri ılık, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri ile dört kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, mikroskoba taşımadan önce hücreleri 300 microliters ılık, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri içinde 30 dakika inkübe edin. Bağlanmamış kalıntı snaps substratını uzaklaştırmak için besiyerini taze, ılık, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme besiyeri ile değiştirin ve hücreleri önceden ısıtılmış 37 degree Celsius ısıtıcı blok üzerindeki bir strafor kutu ile mikroskoba taşıyın.

Floresan yoğunluğu ölçümünden iki saat önce sıcaklık değişimlerini en aza indirmek için, mikroskobun ve tüm bileşenlerinin istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlamak amacıyla iklimlendirme kabininin hava sıcaklığını kuru modda 37 °C'ye ayarlayın. Yoğuşmayı ve buna bağlı olarak mikroskobun zarar görmesini önlemek için, nem ayarını yapmadan önce ön ısıtma yapılması önemlidir.

Tüm mikroskop sistemi 37 °C'ye ulaştığında, hava nemini %60'a ve karbondioksit oranını %5'e ayarlayın. Tarama veya veri toplama yazılımını başlatın ve standart ayarları tanımlayın. Analiz edilecek kuyucukların konumlarını belirleyin. Delta T veya veri toplama döngü süresini ve toplam veri toplama döngü sayısını tanımlayın.

Bu gösterimde, daha fazla sayıda kuyucuğun analizi için donanımsal otomatik odaklama önceden seçilmiştir. Görüntülemeyi başlatın ve ilk iki görüntüleme döngüsünü denetleyin.

Mikroskop, histon H2 GFP sinyaline odaklanacak ve filtre değiştirilip karşılık gelen TMR star görüntüsü alınmadan önce bu kanalda ilk görüntü kaydedilecektir. Bu işlem, bir kuyucuktaki tüm pozisyonlar ve incelenecek kuyucukların her biri için, bir sonraki döngü tekrarlanmadan önce tekrarlanır. Proteolitik profilleri analiz etmek için scan R analiz yazılımını başlatın.

Sinyal yoğunluğuna dayalı bir eşik değeri ve komşu hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için bir watershed algoritması kullanılarak, histon H2 GFP ile görselleştirilen hücre çekirdeklerinin ana nesne olarak tanımlandığı görüntüleri analiz edin. TMR* analizi için sitoplazma ile birlikte çekirdekten oluşan bir alt nesne oluşturulmalıdır. Ana nesnenin önemli özellikleri X ve Y konumları, zaman ve GFP'nin maksimum ve ortalama yoğunluklarının yanı sıra ana nesne için toplam yoğunluğun alana bölünmüş değeridir.

TMR star alt nesnesi için, alt nesne ortalama TMR star floresans yoğunluğunun zaman içindeki değişimini veya analiz edilen ana nesnelere atanmış hücre izlerini görselleştirmek amacıyla izleme moduna geçin. Daha fazla sayıda hücreye bakmak, ilk temsilci ve objektif görünümü sağlar; ancak incelenecek hücre sayısı, en az 140 döngü süren ve yüksek maksimum histon H iki GFP yoğunluğu içeren ölçümler üzerinde kapılama (gating) yapılarak daraltılabilir. Tek hücre düzeyinde histon H iki GFP ve TMR star floresansını eş zamanlı olarak görselleştirmek için ilgilendiğiniz bir hücre izini seçin.

Farenin sağ tuşunu kullanarak, ilgilenilen bir hücreye tıklayın ve dışa aktarılabilir bir görüntü oluşturun. Her bir zaman noktası için histon H2 GFP ve cycling B snap TMR star'ın gösterildiği galeri. Tarayıcı analiz yazılımını popülasyon moduna getirin ve nokta grafiğinde (dot blot) ilgilenilen hücrenin temsil edildiği bölgeyi seçin (gate edin).

Kapılı bölgeye yeni bir nokta grafiği (dot plot) penceresi uygulayın ve zaman içindeki ortalama TMR star floresan yoğunluğunu görselleştirin. Daha fazla hesaplama yapmak için verileri Microsoft Excel'e aktarın. Buradaki şekiller, çekirdek zarının parçalanması (nuclear envelope breakdown veya NEBD) sonrası sitoplazmanın sıkışmasıyla birlikte kromozomal hizalanma bozukluğu belirtileri göstermeden düzenli bir mitoz geçiren bir hücrenin TMR star floresan yoğunluk eğrisi ile temsil edilen Siklin B kinetiğini betimlemektedir; kırmızı üçgenle belirtildiği üzere TMR star floresan yoğunluğu, izomorfik pencereye ulaşılana kadar ani bir artış gösterir.

Hücre prometafaza girdiğinde, profaz ve metafaz boyunca ilerlediği sürece floresan yoğunluğu stabil bir seviyede kalır ve ardından hızla düşmeye başlar. Tüm kromozomlar stabil bir metafaz plağı oluşturduğunda, bu düşüş kromozom ayrılmasını takip eder. Geç mitozda eğri üzerindeki mavi nokta ile belirtilen anafaz sırasında, kromatin dekondans olmaya başlar ve hücre interfaz morfolojisine geçer.

Floresans yoğunluk eğrisi, mitoz sonrası gelişen ve mitoz öncesindeki platodan daha düşük olan plato seviyesine yaklaşırken. Bu teknik, mitoz alanındaki araştırmacıların, mitotik ilerlemeyi düzenleyen döngü, degradasyon ve sentez arasındaki hassas dengeyi keşfetmelerinin yolunu açmıştır.