Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videonun amacı, fare kalbinden izole edilen mitokondrilerde mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılmasını karakterize etme prosedürünü açıklamaktır. İlk olarak, fare kalplerinden mitokondriler izole edilir.

Diferansiyel santrifüj yöntemi kullanılarak izole edilen mitokondrilerin kalitesi, solunum kontrol oranını ölçmek ve mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek amacıyla bir bilgisayara bağlı oksijen elektrodu kullanılarak belirlenir. Ardından, spektroflorometrik cihazlar kullanılarak kalsiyum yönetimi, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmin eş zamanlı ölçümleri, geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılma durumunu belirlemek için kullanılır.

Elde edilen veriler, kalsiyum tutma kapasitesi ve mitokondriyal geçirgenlik geçişinde farklılıklar göstermiştir. İzole mitokondrilerin düşük hassasiyeti ve mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılması, mitokondriyal fizyoloji ve anatomide birkaç düzeyde meydana gelen değişiklikleri içeren karmaşık bir fenomendir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, aynı anda birden fazla parametrenin ölçülmesinin, kalsiyum, mobilizasyon veya şişme gibi tekil parametrelerin tek başına ölçülmesine kıyasla fenomene dair daha kapsamlı bir tablo sunmasıdır. Prosedüre başlamadan önce, mitokondri izolasyon tamponunu çözdürün ve pH değerinin 7.4 olması gerektiğini kontrol edin. Ardından, kullanılacak tüm tamponları, kapları ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Mitokondri izolasyon protokolünün tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Ötanazi uygulanmış farelerin kalplerini bir Petri kabına yerleştirin ve üzerindeki kanı soğuk mitokondri izolasyon tamponu ile durulayın. Ardından, kalpleri bir bistüri yardımıyla yeni bir Petri kabına aktarın, yağ dokusunu ve atriyumları uzaklaştırın, daha sonra homojen bir ürün elde edilene kadar kalpleri ince ince kıyın.

Kıyılmış kalpleri 50 milliliter'lik konik tüpe aktarın. İçeriğinde 0.1 milligram per milliliter tripsin bulunan 10 milliliter mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve örneğin buz üzerinde 10 dakika boyunca sindirilmesini sağlayın. Tripsin kullanımının izole edilen mitokondri verimini artırdığını ve mitokondri hazırlıkları arasında sabit tutulması gerektiğini unutmayın.

Bununla birlikte, enzimin iyonlarla etkileşime girmediğinden emin olmak için, izole edilen mitokondrilerin fonksiyonelliğinin tripsin kullanılmadan elde edilen preparatlar üzerinde test edilmesini öneririz. İnkübasyon sonrası, %0,1 yağ asidi içermeyen BS, a ve beş miligram tripsin inhibitörü içeren 10 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tripsini nötralize etmek için, sindirilmiş dokuyu düşük ila orta hızda, dört derece Celsius'ta bir dakika santrifüj ederek geri kazanın.

Santrifüj sonrası resüspansiyondan sonra, örneği buz üzerinde tutarak, %0,1 yağ asidi içermeyen BSA içeren sekiz mililitre mitokondri izolasyon tamponunda süspande edin. Örneği, Teflon havan eli olan motorlu bir Dounce homojenizatör kullanarak 1.200 ile 1.400 RPM arasında dört ila altı geçişle homojenize edin. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüjleyin.

Çekirdekleri ve doku kalıntılarını çöktürmek için. Santrifüjden sonra, mitokondri içeren süpernatantı mikro santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 8,000 ×g hızında santrifüjleyin. Santrifüj sonrası, pelletin üzerinde beyaz bir tabaka oluşacaktır.

Mitokondriyal peletin üzerindeki beyaz tabakayı dikkatlice aspire etmek ve uzaklaştırmak için bir vakum sistemi kullanın. Ardından, mitokondrileri içeren geri kalan daha koyu renkli peleti bir mililitre mitokondri izolasyon tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.

Ardından, mitokondriyaları 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve mitokondri pelletini 150 µL mitokondri izolasyon tamponu içerisinde yeniden süspande edin; mitokondriyaları buz üzerinde muhafaza edin.

İzole mitokondrilerin solunumu, bir bilgisayara bağlı ve oxy. The plus yazılımı ile kontrol edilen bir oxy thermal oksijen elektrodu ile ölçülür. Oksijen elektrodu, deney günü kalibre edilmelidir. Son konsantrasyonu 1 µM rotenon içeren iki mL mitokondri solunum tamponu oxy odasına ekleyin, odayı mühürleyin ve oksijen sinyalinin kaydına başlayın.

Sistem tarafından kaydedilen ve bilgisayar ekranında görüntülenen sinyal, oxy therm haznesindeki oksijen konsantrasyonu ile orantılıdır. Oksijen sinyali stabilize olduğunda, 250 µg mitokondri ekleyin ve bir dakika boyunca bazal respirasyonu kaydedin. Mitokondriler endojen substratlar üzerinde solunum yaptıkları için, bu noktadaki respirasyon çok düşük olmalıdır.

Bu, durum bir solunumdur. Kompleks iki'de mitokondriyal solunumu başlatmak için final konsantrasyonu 5 mM olacak şekilde süksinat ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. Durum iki solunumu sırasında oksijen tüketimi artmalıdır.

Durum respirasyonunu indüklemek için, final konsantrasyonu 150 micromolar olacak şekilde DP ekleyin. Bu noktada, oksidatif fosforilasyon yoluyla TP sentezi nedeniyle oksijen tüketimi artmalıdır. Respirasyon yavaşlayana kadar sinyali kaydedin; bu durum DP tüketimini ve durum dört respirasyon kaydına geçişi gösterir.

Dördüncü aşama, en az bir dakika boyunca respirasyon. Final konsantrasyonu 1 µM olacak şekilde CCCP ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. Bu noktada, ayrık (uncoupled) respirasyon maksimum seviyede olmalıdır.

Durum üç solunumu sırasındaki oksijen tüketim hızını, durum dört solunumu sırasındaki oksijen tüketim hızına bölerek solunumsal kontrol oranını (RCR) hesaplayın; hedef RCR değeri dörtten büyük olmalıdır. Ardından, mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek için, yeni bir mitokondri örneğine final konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde DP ekleyerek durum üç solunumunu başlatın.

Ardından bir dakika boyunca oksijen tüketimini kaydedin, 10 µM sitokrom C ekleyin ve iki ila üç dakika boyunca oksijen tüketimini tekrar kaydedin. İyi bir mitokondri hazırlığında, sitokrom C sağlam mitokondriyal membranlardan geçemeyeceği için respirasyonda bir artış olmaz veya çok küçük bir artış görülür. Respirasyondaki artış, mitokondriyal membranların parçalandığını veya hasar gördüğünü gösterir.

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin çok parametreli ölçümü için kullanılan düzenek, Felix GX programı tarafından bilgisayar kontrollü bir kuantum master çift emisyonli spektroflorimetreden oluşmaktadır. Felix GX programını kullanarak çok boyutlu bir veri toplama protokolü oluşturun ve rasyometrik boyalar olan Forer ve JC-1 için kalsiyum, mitokondriyal membran potansiyeli ve şişme ölçüm parametrelerini girin; Forer oranı ve JC-1 oranı için türetilmiş izler oluşturun. Tek kullanımlık dört taraflı meth ACRL vete'ye, final konsantrasyonu 1 µM rotenon, 5 mM süksinat ve 800 nM olan 1 mL mitokondri assay tamponu karıştırın. Forer için 250 µg mitokondri ekleyin ve numuneyi spektroflorimetrenin numune bölmesine yerleştirin.

Bir dakika sonra floresan sinyallerini kaydetmeye başlayın, veri toplamayı durdurun, 500 nanomolar JC-1 ekleyin ve ardından veri toplamayı yeniden başlatın. JC-1 oran sinyali, aktif mitokondriler tarafından boya alımını belirtecek şekilde artmalıdır. JC-1 sinyali bir platoya ulaşana kadar kayda devam edin.

Genellikle beş dakika içinde, final konsantrasyonu 20 micromolar olacak şekilde kalsiyum klorür ekleyin. Analiz tamponunda artan kalsiyum varlığını temsil eden Fluor FF oran sinyalinde anlık bir artış, ardından mitokondriyal kalsiyum alımı nedeniyle kademeli bir azalma görülmelidir. JC one oran sinyali, hafif mitokondriyal membran depolarizasyonuna işaret eden kısa süreli ve geçici bir azalma göstermelidir.

ER FF oranı sinyali, genellikle 20 µM kalsiyum klorür uygulamasının ardından bir ila 1,5 dakika içinde bazal seviyeye döndüğünde, mitokondriler kalsiyum biriktiremeyip kalsiyumu analiz tamponuna salmaya başlayana kadar sabit aralıklarla darbeler vermeye devam edin. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş porunun açılması, kalsiyum salınımı nedeniyle URA FF oranı sinyalindeki eş zamanlı artışla gözlemlenir. C 56 black six J farelerinden izole edilen mitokondrilerde, membran potansiyelinin çökmesi nedeniyle JC one sinyal oranında bir azalma ve mitokondriyal şişme nedeniyle ışık saçılımında bir azalma görülür.

Bu videoda gösterildiği gibi, oksijen tüketimi daha sonra süksinat ve ADP varlığında durum üç solunumu sırasında ve burada gösterildiği üzere ADP tüketiminden sonra durum dört solunumu sırasında ölçülmüştür; ADP eklemesi, oksidatif fosforilasyon nedeniyle oksijen tüketimini artırır ve ardından oksijen tüketimi yavaşlar. Tüm ADP tüketildiğinde, izole mitokondrilerinle ilgili eşleşmeyi bozma tepkisi, CCCP eklenmesiyle CCCP varlığında ölçülür. İzole mitokondrilerin membran bütünlüğünü değerlendirmek için oksijen tüketim hızı, durum üç solunumu sırasındakinden daha yüksektir.

Oksijen tüketimi, süksinat ve a DP varlığında ve sitokrom C eklemesinden sonra ölçüldü. Burada görüldüğü üzere, sitokrom C eklenmesi, a DP ve süksinata kıyasla oksijen tüketimini anlamlı şekilde artırmamaktadır; bu durum, bozulmamış mitokondriyal membranların sitokrom C'ye geçirgen olmadığını göstermektedir. Mitokondriyal geçirgenlik geçişini değerlendirmek için, izole kalp mitokondrilerinde mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesinin bir göstergesi olarak düşük açılım (poor opening) incelenmiştir. Mitokondriyal geçirgenlik geçişindeki düşük açılım, 20 µM'lık ardışık eklemelerle tetiklenmiştir.

Kalsiyum klorür, ekstramitokondriyal kalsiyum ve membran potansiyeli rasyometrik indikatörler ile ölçülmüştür. Yeşil izle gösterilen URA FF ve kırmızı izle gösterilen JC-1 kullanılmıştır; mitokondri şişmesi, siyah izle gösterilen 525 nanometredeki ışık saçılımının kaydedilmesiyle ölçülmüştür. JC-1 ve şişme sinyallerinin özgüllüğü, 1 µM CCCP ve 5 µg/mL mikrobiyal toksin etin ile test edilmiştir; burada görüldüğü üzere, mitokondriler tarafından kalsiyum alımına mitokondriyal membranın hafif bir depolarizasyonu eşlik etmektedir.

Dört kalsiyum pulsundan sonra, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılması, kalsiyum salınımını belirten URA FF artışı olarak görülür. Membran potansiyeli çöküşünü belirten JC-1 azalması ve mitokondriyal matris hacmindeki artış, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri açılmasının özgüllüğünü doğrulamak için şişme belirteci olarak ışık saçılımındaki azalma şeklinde izlenir. Aynı ölçümler, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri bileşeni siklofillin D'ye bağlanan siklosporin A varlığında gerçekleştirilmiştir. Bu şekildete gösterildiği gibi, bir mikromolar siklosporin A varlığı, kontrol örneğine kıyasla mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerini açmak için gereken kalsiyum klorür pulslarının sayısını artırır.

Bu videoyu izledikten sonra, izole kalp mitokondrilerinde mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılmasının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün en zor yönü, iyi kalitede izole mitokondri elde etmektir. Bu nedenle, mitokondrileri daha ileri deneyler için kullanmadan önce kalite kontrol ölçümlerinin yapılması önemlidir.