On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Bu videonun amacı, endotel hücrelerin enflamatuar durumunu karakterize etmek için bir çip üstü laboratuvar tekniğini göstermektir. İlk olarak, insan aort endotel hücreleri bir doku kültürü alt tabakasında konfluense ulaşana kadar büyütülür ve ardından bir Conan plak makaslama cihazına yerleştirilir. Hücreler, proenflamatuar sitokin TNF alpha ile işleme tabi tutulur ve aynı zamanda, alt tabakanın üzerindeki koninin dönüşü hassas bir şekilde kontrol edilerek dört saat boyunca farklı makaslama gerilimi koşullarına maruz bırakılır; makaslama gerilimi, sitokine karşı iyi karakterize edilmiş enflamatuar yanıtı modüle eder.

Bu durum, VCAM-1 ve ICAM-1 gibi adezyon moleküllerinin artışını içerir. Substrat, PDMS mikroakışkan cihazın monolayer üzerine vakumla mühürlenerek akış kanallarının oluşturulduğu bir mikroskop tablasına aktarılır. Aktive edilmiş monositik THP-1 hücreleri, hücre adezyon molekülü ekspresyon seviyesiyle orantılı olarak bağlandıkları ön koşullandırılmış HUVEC hücreleri üzerinden akıtılır.

Endotelinin inflamatuar durumu, sıkıca tutunmuş toplam THP-1 hücresi sayısının belirlenmesiyle tespit edilir. Merhaba, benim adım She D Diverse, ben Greg Foster ve ben de Keith Bailey.

California Üniversitesi Davis'teki Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Profesör Pastor ve Simon'ın laboratuvarlarındayız. Bugün, endotelyal disfonksiyon ve inflamasyonu kantitatif olarak incelemek için çip üstü laboratuvar tabanlı bir yaklaşımın kullanımını anlatacağız. Bu araçlar, metabolik stresin hidrodinamik faktörlerle üst üste binmesi ile endotelyal inflamatuar fenotipin düzenlenmesi ve ateroskleroz duyarlılığına ilişkin çalışmalar yürütmemiz için bir platform sağlamaktadır.

Bu nedenle cihazlarımızı vasküler mimetik mikroakışkan odacıklar veya vmmc olarak adlandırıyoruz. Bu cihazlar, aterojenik damarlardakileri taklit eden koşullar altında, endotel hücrelerdeki ve monositlerdeki inflamatuar sonuçları nicelleştirmemize olanak tanır. VMMC, miktarı sınırlı olabilecek reaktiflerin veya malzemelerin küçük miktarlarda kullanılmasına kolaylık sağlar.

Ayrıca birçok özelleştirilebilir düzen ve geometride inşa edilebilirler, bu da onları çok geniş bir uygulama yelpazesi için oldukça uygun hale getirir. Bugün, çip üstü laboratuvar yaklaşımımızı kullanan temsili bir deneyi göstereceğiz. İnsan endotel tek katmanları, iyi tanımlanmış kayma gerilmeleri altında sitokin aktivasyonuna maruz bırakılacaktır.

Bir torna tezgahı kullanarak 100 milimetrelik doku kültürü kaplarından üç inçlik dairesel altlıklar hazırlanır; bu yöntemle, endotel aktivasyonunun fonksiyonel bir çıktısı olarak insan monosit hücrelerinin tek tabakaya göçünün gerçek zamanlı olarak miktarını belirlemek için VMC kullanımını göstereceğiz. Üç inçlik altlıklar distile su ile yıkanır ve ardından %70 ethanol içinde bekletilerek sterilize edilir. Steril altlıklar 100 milimetrelik Petri kaplarına yerleştirilir ve kurumaya bırakılır.

Ardından, oda sıcaklığında bir saat boyunca 100 µg/mL konsantrasyonda tip 1 kolajen ile inkübe edilirler ve PBS ile yıkanırlar. İnsan aortik endotel hücreleri veya HA, 650.000 hücre/mL konsantrasyonda süspanse edilir. Bir mililitre hücre süspansiyonu, kurutulmuş kolajen kaplı bir substrat üzerine damlacıklar halinde yerleştirilir ve eşit bir süspansiyon şeklinde yayılır.

Ekilmiş substratlar daha sonra 37 °C %5CO2'li bir inkübatöre yerleştirilir ve substrat yüzeyine tutunmaları beklenir. Bir saat sonra dokuz mililitre E GM two büyüme ortamı eklenir ve hücrelerin yaklaşık %90 konfluensle monokatmanlar oluşturacak şekilde büyümeleri sağlanır; monokatmanlar sonraki kayma deneylerinde kullanılmaya hazırdır. Vasküler mimetik mikroakışkan odacıklar, istenen kanal geometrisini içeren bir ana kalıbın üzerine A-P-D-M-S dökülerek oluşturulur.

Silikon baz, plastik bir şekillendirme teknesine dökülür ve ardından ağırlıkça 10'a 1 oranında silikon kürleme ajanı eklenir. PDMS jel, şekillendirme teknesinin kenarları sıyrılmamasına ve böylece karışıma plastik parçacıklar karışmamasına dikkat edilerek iyice karıştırılır. Fotorezist kalıplar heksan ile temizlenir ve VMMC'yi kalıplamak üzere hazırlanır.

Ardından PDMS Karışımı master kalıbın üzerine dökülür ve vakum odasına yerleştirilir. Oda içerisinde, PDMS karışımındaki hava 15 dakika sonra yüzeye çıkarak uzaklaştırılır.

Kalıp odacıktan çıkarılır ve kalıpta kalan hava kabarcıklarını temizlemek için PDMS yüzeyine nazikçe hava püskürtülür. Ardından kalıp kapatılır ve PDMS'in kürlenmesi için bir saat boyunca 37 °C'lik bir fırına yerleştirilir. Katılaşmış PDMS jeli fırından çıkarılır ve küçük bir bistüri kullanılarak odacığın etrafına dairesel kesikler atılır.

Ana kalıba zarar vereceği için fotoresist malzemesiyle temastan kaçınmak adına, bu işlemin kademeli olarak yapılması kritik önem taşır. 19 gauge lure lock iğne kullanarak, her kanal için mikroakışkan kanalı kalıp zımba giriş ve çıkış portlarından kesin. Ek olarak, kanallardan uzağa vakum tüpleri için delikler açın.

VMMC hazırlığı tamamlanmıştır. Nihai konsantrasyon 0,5 ng/mL olacak şekilde, pro-inflamatuar sitokin TNF alpha'yı altı mililitre L 15 medyumuna pipetleyin. L 15 medyumu, %5CO2 yokluğundaki pH tamponlama kapasitesi nedeniyle burada kayma sıvısı olarak kullanılmaktadır.

Ardından besiyeri, kayma cihazını doldurmak için kullanılan steril 10 mililitrelik bir şırıngaya çekilir. Konfluent monolayer, etanolle sterilize edilmiş, dengelenmiş ve koni boşluk yüksekliği ayarlanmış olan hücre kayma cihazına aktarılır. Substrat Petri kabından çıkarılır, cam mastar bloğun üzerine yerleştirilir, merkezlenir ve koni doğrudan hücrelerin üzerinde olacak şekilde gövde haznesinin altına dikkatlice yerleştirilir.

Substrat, mastar bloğu etrafındaki paslanmaz çelik vidalar eşit şekilde sıkılarak sabitlenir. Ardından, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilerek kesme ortamı hazneye yüklenir. Sonrasında, istenen kesme gerilimi programını girmek için bir bilgisayar kullanılır ve mikro step motor açılır.

Burada, sıfır artı veya eksi 5 dyne/cm²'lik bir salınımlı kayma kuvveti uyguluyoruz. Dört saat sonra, kayma programı durdurulur. Mastar bloğu çıkarılır ve substrat dikkatlice Petri kabına geri yerleştirilir.

Hücreler artık monosit adezyon testi için hazırdır. Kesme işleminden hemen sonra, HA tek tabakaları VMMC'nin kurulumu için mikroskop istasyonuna taşınır. Kanal içinde hapsolmuş hava kabarcıklarını gidermek için VMMC vakum hortumuna bağlanır ve DI suyun içine daldırılır.

Vakum valfi başlangıçta kapalıyken, hazne dikkatlice tek tabakanın üzerine bastırılır ve vakum valfi açılır. Burada, hazne kanalları içerisinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak kritik önem taşır. Ardından, ucu kesilmiş 19 Gauge luer lock iğneden yapılmış bir rezervuara 80 µL kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS pipetlenir; rezervuarın üst kısmına sıkıca bastırılarak sıvı uçtan dışarı itilir ve ardından bu uç VMMC'nin giriş portuna yerleştirilir.

Tüm düzenek mikroskop tablasına yerleştirilir, mikroskop kamerası ve video monitörü açılır. Şırınga pompasına 10 milliliter'lik bir cam şırınga takılır. Ardından, şırınga borusu VMMC'nin çıkış portuna bağlanır.

Akış hızı, kanal içerisinde santimetrekare başına bir dine değerinde bir kayma gerilimi oluşturacak şekilde ayarlanır ve ardından şırınganın rezervuardan kanal boyunca sıvı çekeceği yeniden doldurma modunda çalıştırılır. SDF one ile stimüle edilen TH P one hücreleri, mililitrede 2 milyon hücre konsantrasyonunda süspanse edilir. Akış aktivasyonundan sonraki iki dakika içerisinde, rezervuara 50 µL hücre süspansiyonu eklenir.

Akış tamamen geliştiğinde, hava kabarcığı oluşmamasına tekrar dikkat edilir. Video saniyede üç kare hızında kaydedilir ve veriler Image J yazılımı kullanılarak sayılır. Adherent THP-1 hücreleri, 10 saniye içinde hücre çapının yarısından fazla hareket etmeyen hücreler olarak tanımlanır.

Burada, TNF alpha ile stimüle edilen ve ya 15 dines per centimeter squared'lik sabit yüksek bir duvar kayma gerilimi ya da sıfır artı veya eksi beş dines per centimeter squared'lik bir osilatuar kayma gerilimi altında kondisyonlanan ha tek tabakalarına THP one adezyonunu betimleyen verileri sunuyoruz. Osilatuar kayma gerilimi ile kondisyonlanan ha tek tabakaları, yüksek kayma gerilimine maruz kalan tek tabakalara kıyasla üç kat daha fazla TP one hücre göçü sergilemiştir. Bugün, aterosklerozun altında yatan erken inflamatuar olaylar hakkında önemli bilgiler sağlamak için birleştirilebilen özelleştirilebilir in vitro tekniklerin kullanımını gösteriyoruz. Spesifik olarak, iyi tanımlanmış hidrodinamik koşullar altında inflamatuar stimülilere maruz kalan hücreler ve endotelyal disfonksiyon ile ilişkili sonuçları nicelendiriyoruz.

VMM CS kullanımı, endotelyal ve lökosit adezyon etkileşimlerinin altında yatan spesifik mekanizmaları incelememize olanak tanır. Bu cihazlar ayrıca esnek ve düşük maliyetli olma avantajına sahiptir ve insan deneklerden elde edilen serum türevli bileşenler gibi tedariki sınırlı olabilen materyallerin kullanımını kolaylaştırır. Bu cihazları uyguladığımız çalışmalarımız; endotelyal hücrelerde sitokin, lipid ve RAGE kaynaklı inflamasyon araştırmalarını kapsamıştır.

Ayrıca, çeşitli lökosit türlerinin yanı sıra tam kanda da adhezyon mekanizmalarını inceleyen çip üstü assay'ler geliştirdik. Nihayetinde, bu teknolojinin, bireylerin inflamasyon kaynaklı kardiyovasküler hastalık riskini değerlendirmek için ex vivo yaklaşımlara öncülük edeceğini öngörüyoruz.