Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, geniş bir görüntüleme hacmi üzerinden biyolojik örneklerin çip üzerinde lenzsiz üç boyutlu görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle numunenin doğrudan sensör çipi üzerine yerleştirilmesi ve kısmi koherent aydınlatma sağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise kayıt yapmak için farklı konumlardaki ışık kaynağının yanal olarak kaydırılmasıdır.

Numunenin alt piksellerle kaydırılmış holografik görüntüleri. Sonraki alt pikseller kaydırılmıştır. Tomografik görüntüleme için holografik görüntüler, aydınlatmanın katları şeklinde kaydedilir.

Son adım, örneğin üç boyutlu tomografik görüntülerini nihai olarak elde etmek için toplanan veri setinin dijital olarak yeniden yapılandırıldığı veri işlemedir. Bu tekniğin konvansiyonel ışık mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kompakt bir mimaride yüksek verimli görüntüleme sağlamasıdır. Bu özellik, platformumuzu özellikle Lab-on-a-chip platformlarıyla entegrasyon için kullanışlı kılmaktadır.

Bu raporda, statik numunelerin tomografisine yönelik masaüstü bir uygulama için temel görüntüleme düzeneği açıklanmaktadır. Bir ksenon lambalı monokromatör, 450 ila 650 nanometre arasındaki bir merkez dalga boyu civarında yaklaşık bir ila 10 nanometre spektral genişliğe sahip bir çıktı sağlayacak şekilde ayarlanmıştır. Bu kısmi koherent çıktı, sisteme kısmi koherent ışık iletmek için daha sonra bir çok modlu optik fiberle bağlanmıştır.

Aydınlatma açısını değiştirmek için optik fiber, motorlu bir rotasyon tablasına monte edilir. Işık kaynağının takılı olduğu motorlu tabla, tespit için belirli bir açıdaki ışık kaynağının düzlem içi kaymalarını sağlamak amacıyla kullanılan iki boyutlu lineer bir XY tablası üzerine monte edilmiştir. Piksel boyutu 2.2 mikron olan, beş megapiksellik bir A-C-M-O-S sensör dizisi kullanılır.

Dedektör, numunelerin geniş görüş alanlı holografik görüntülerinin kaydedilmesi için kullanılır. Sensörün, geniş aydınlatma açılarında yeterli ışık alıp almadığını kontrol edebilmek için, sensör dizisinin ışık kaynağının dönme ekseniyle aynı eksen düzleminde konumlandırılması kritik önem taşır. Lenssiz optik tomografi hücreler ve mikroorganizmalar gibi çeşitli nesneleri görüntüleyebilse de, temel prensipler burada bir bisturi veya spatula kullanılarak bir deniz eriştesi numunesinin üç boyutlu mikroskopisi gerçekleştirilerek gösterilmektedir.

Sızdırmazlık organı kültürünün bulunduğu Petri kabından küçük bir AGA parçası alın. Her boyutu birkaç milimetre olan kübik bir parça, yüzlerce nematod içerecektir. Agar parçasını, bir mililitre deiyonize su içeren bir polipropilen viyale yerleştirin.

30 saniye ile bir dakika boyunca hafifçe vorteksleyin. 10 ila 15 dakika sonra, solucan agar üzerinden iyonize edilmemiş suya doğru sürünmelidir. Solucanları geçici olarak hareketsiz hale getirmek için buradaki solucanların görülmeyecek kadar küçük olduğunu ve bir mililitre 5 ila 10 milimolar Lima kullanıldığını not edin.

Çözeltiyi hazırlayın ve 10 dakika bekleyin. Vialin tabanından beş ila 10 µL örnek alıp iki lam arasında sıkıştırın. Geçici olarak immobilize edilmiş çok sayıda solucan içeren bu örnek, veri toplama işlemini başlatmak için dedektör üzerine yerleştirilebilir.

Gösterim amaçlı olarak, tipik bir lenssiz optik tomografi veya LOT deneyinin görüntüleme adımları bu bölümde özetlenmiştir; ancak tüm süreç, özel olarak geliştirilen lab view arayüzü kullanılarak otomatikleştirilmiştir. Manuel adımlara başlamak için, sıfır derecenin ışık kaynağının dikey konumuna karşılık geldiği rotasyon tablasının başlangıç açısını negatif 50 dereceye ayarlayın. XY tablasının başlangıç konumunu, başlangıç noktası olan sıfır sıfıra ayarlayın.

Rotasyon tablasının açısını değiştirmeden, görüntünün doygun pikseller içermeyecek şekilde mümkün olduğunca parlak olmasını sağlayarak, dedektörün dinamik aralığından en iyi şekilde yararlanmak için pozlama süresini ayarlayın. Her bir görüntü için dokuz görüntü yakalayın. XY tablasını, her bir görüntünün bir öncekine kıyasla yaklaşık bir pikselin dörtte biri kadar kayacağı şekilde, üç çarpı üçlük bir kare ızgara düzeninde yeni bir konuma taşıyın.

Nesnenin türüne ve sinyal-gürültü oranına bağlı olarak, her açıda daha fazla görüntü almak çözünürlüğü artırabilir. İlk açıda dokuz görüntü topladıktan sonra, XY tablasının konumunu sıfır sıfır konumuna geri getirin. Ardından, döner tablanın açısını pozitif 50 dereceye ulaşana kadar ikişer derecelik artışlarla yükseltin.

Her yeni açıda yapılan her artıştan sonra, açıklanan adımları tekrarlayın. Açısal artışlar, görüntüleme çözünürlüğü ile veri toplama süresinin optimizasyonuna bağlı olarak daha küçük veya daha büyük olabilir. Veri toplama işleminin ardından, 51 farklı aydınlatma açısının her biri için dokuz adet alt-piksel kaydırılmış görüntü içeren toplam 459 görüntülük bir set elde edilir.

Dokuz görüntüden oluşan her bir set, tek bir yüksek çözünürlüklü projeksiyon elde etmek için piksel süper çözünürlük algoritmaları kullanılarak dijital olarak işlenir. Ardından, açı başına hologram piksel süper sonucu, 51 projeksiyon görüntüsü elde etmek için dijital olarak yeniden yapılandırılır. Veri işleme süreci burada bir dizüstü bilgisayar kullanılarak gösterilmiştir.

Grafik işlem birimleri kullanılarak tüm görüş alanı için yeniden yapılandırma işlemi bir saniyeden daha kısa sürer. Bu 51 projeksiyon görüntüsünden oluşan set, daha sonra Tom OJA eklentisi kullanılarak geri projekte edilir. Image J'de, projeksiyon görüntüleri önce Image J'ye yüklenir ve ardından Tom OJ eklentisi çalıştırılır.

Her bir projeksiyon görüntüsü için izleme açısını sağlayan bir arama tablosu OJ'ye yüklenir. Ağırlıklı geri projeksiyon yöntemi kullanılarak, numunenin üç boyutlu tomografik görüntüleri elde edilebilir. Lenssiz optik tomografinin geniş görüş alanı, numunenin doğrudan dedektör dizisinin üzerine yerleştirilmesiyle burada gösterilmiştir. Nesnelerin holografik görüntüleri 24 milimetre karelik bir görüş alanı üzerinden kaydedilebilir ve bu alan, daha geniş aktif alanlara sahip gelişmekte olan dedektör dizileri kullanılarak daha da artırılabilir.

Detektör dizisinin piksel boyutu kaydedilen holografik görüntülerin çözünürlüğünü sınırlasa da, piksel süper çözünürlük teknikleri bu sorunu hafifletmektedir; burada, üç farklı aydınlatma açısı için mikrometre altı mekansal çözünürlük sunan yeniden oluşturulmuş projeksiyon görüntüleri ile birlikte piksel süper çözünürlüklü hologramlar gösterilmektedir. Projeksiyon görüntüleri, örneğin TOM görüntülerinden hesaplamak için tomografik görüntü yeniden oluşturma teknikleri kullanılarak birleştirilebilir. Solucanın ön kısmından geçen XY düzlemindeki üç kesit görüntüsü burada gösterilmiştir; yaklaşık beş mikron dış çapa sahip olan bu yaklaşık silindirik yapıdan beklendiği üzere, faringeal tüp yalnızca Z eşittir sekiz mikron olan kesitte görünür durumdadır.

Ayrıca, XZ düzlemindeki kesit görüntüsü, solucanın sınırlarını ve içindeki farenks tüpünü net bir şekilde göstererek farenksin başarılı bir şekilde 3D görüntülemesini kanıtlamaktadır. Geliştirilmesiyle birlikte bu teknik, araştırmacıların onlarca milimetrelik görüntüleme hacmine sahip tüpler üzerinde üç boyutlu mikroskopi yapmalarının önünü açabilir. Bu nedenle, lenssiz optik tomografi, laboratuvar çipleri (lab-on-a-chip) platformlarında yüksek verimli görüntüleme uygulamaları için faydalı bir araç olabilir.