Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Bu prosedürün genel amacı, bir doğru akım elektrik alanı varlığında yetişkin kaynaklı nöral öncül hücrelerin göçünü görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle yetişkin fareden subependimal nöral öncül hücrelerin izole edilmesi ve kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, Galvan Axxis odacıklarının hazırlanması ve nöral öncül hücrelerin bu odacıklara aktarılmasıdır.

Son adım, Galvan Axxis haznesi boyunca bir doğru akım elektrik alanı uygulamak ve nöro öncül hücrelerin göçünü gözlemlemek için zaman ayarlı görüntüleme yapmaktır. Nihayetinde, zaman ayarlı görüntüleme mikroskopisi, nöro öncül hücrelerin farklılaşmış ve farklılaşmamış durumlarındaki galvan taktiktik özelliklerini yakalar. Bu yöntem nöro öncül hücre galvanotaksisi hakkında bilgi sağlayabilse de, nöro onarımı artırmak amacıyla nöro öncül hücrelerin lezyon bölgelerine çekildiği bir fare inme modeli gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Rob Pilley Post uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlandığında, serbest yüzen primer nörosferlerin hasada hazır olması için NPC'ler yedi gündür kültürde olmalıdır. Gerektiğinde, üç adet kare cam yerleştirerek üç Galvan Axxis odasını hazırlamaya başlayın.

Birinci adımda, lamelleri bir şişe 6 N hidroklorik asit içerisinde gece boyunca bekletin. Ertesi gün sabah erken saatlerde, Matrigel'in buz üzerinde yavaşça çözünmesini sağlayın. Dört saat sonra, Matrigel odağı oluşturmak için kullanıma hazır hale gelecektir.

İlk olarak, yeni bir kareden altı adet dikdörtgen cam şerit kesmek için elmas uçlu bir cam kesici kullanın. Bir numara, lameller. Asitle yıkanmış kare lamelleri ve dikdörtgen lamelleri laminar akışlı kabine aktarın.

Cam şeritleri önce %70 etanol ile, ardından doku kültürü kalitesinde otoklavlanmış su ile yıkayın. Havada kurumaya bırakın veya tüy bırakmayan kağıt üzerinde kurulayın. Ardından, her bir kare cam lamın bir yüzeyinin çevresine vakum gresi uygulayın ve bunları 60 milimetrelik plastiğin tabanına mühürleyin.

Petri kapları. Dikdörtgen cam şeritlerin bir tarafına vakum gresi sürün ve bunları karenin karşıt kenarlarına sabitleyin. Her kabın merkezinde orta kanallı kareler oluşturmak için lamlar kullanın.

Bu modifiye edilmiş cam kareleri veya odacıkları bir çeker ocak içerisinde en az 15 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Ardından, odacıkların orta haznesine 250 ila 300 microliters polyol lysine pipetleyin. Daha sonra odacıkları oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, inkübasyonun bitiminden yaklaşık 15 dakika önce işlemi tamamlayın.

İki saat sonra Matrigel çözeltisini hazırlayın, polilizin'i aspire edin ve orta kanalları bir mililitre otoklavlanmış su ile yıkayın. Ardından, orta kanallara 250 ila 300 mikrolitre Matrigel çözeltisi pipetleyin ve odacıkları 37 °C'de bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından Matrigel çözeltisini aspire edin.

Ardından merkezi olukları bir ila iki mililitre SFM ile nazikçe yıkayın. Şimdi, kültüre edilmiş hücrelere hazırlık amacıyla merkezi olukların üzerine 100 µL E-F-H-S-F-M veya F-B-S-S-F-M pipetleyin. Sonra, nörosfer içeren kültürden dört ila beş mililitreyi yeni bir 60 mm Petri kabına pipetleyin.

Ardından Petri kabını, sayım mikroskobunun sahnesine 5x görüntüleme objektifinin altına yerleştirin. Her bir bölmenin merkez haznesine beş ila sekiz adet bütün nörosfer transfer etmek için bir P 10 pipet kullanın. En fazla dört.

Nörosferler tek seferde aktarılabilir, ancak merkez oluklarındaki nörosferlerle birleşmelerine izin vermeyin. Matrigel alt tabakasına zarar vermeden dikkatlice çevreye yayın. Ardından merkez olukların üzerine ek olarak 150 µL E-F-H-S-F-M veya F-B-S-S-F-M ekleyin.

Şimdi hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde kültüre edin. 17 ila 20 saatlik kültürleme sonrası, 69 ila 72 saat sonra farklılaşmamış NPC'ler elde edilecektir. Kültürleme sonucunda farklılaşmış NPC'ler hazır olacaktır.

Sayım mikroskobu altında, canlı hücre görüntüleme migrasyon analizi için en uygun hücrelerin bulunduğu hazneyi seçin. Hücreler yuvarlak olmalı, nörosferlerinden neredeyse tamamen ayrılmış olmalı ve henüz uzantılar oluşturmamış veya bir kaput içinde uzantılar oluşturmaya yeni başlamış olmalıdır. Bir hazne kapağı hazırlayın.

Kare bir cam lamı önce %70 etanolle, ardından otoklavlanmış suyla yıkayın ve iki paralel kenara bir şerit vakum gresi uygulayın. Şimdi hazneyi kapatın. Önce merkezi oluktan kültür ortamını aspire edin ve ardından lamı, bir çatı gibi dikdörtgen duvarların üzerine hızla yerleştirerek mühürleyin.

Ardından, kılcal hareket kullanarak merkezi oluğa 100 microliters taze besiyeri yükleyin. Şimdi, kültür besiyeri havuzları için vakum gresi ile sınırlar oluşturun. Canlı hücre görüntüleme sistemindeki merkezi oluğun her iki ucunda; hazırlanmış agaroz jel tüpleri, gümüş, gümüş klorür elektrotlar ve kullanılmak üzere iki adet 60 millimeter petri kabı bulundurun.

Kültür ortamı rezervuarları olarak, odacıkların 37 °C %5 karbondioksit ortamında 20 ila 30 dakika boyunca dinlenmesine izin verin. Bu süre zarfında, iki boş Petri kabının kapaklarını ve Galvan Axxis odacıkları Petri kabının kapağını bir Dremel veya pipet aletiyle delerek hazırlayın; merkezi oluğun her iki yanına 1,5 ila 2 mL ortam ekleyin ve her bir boş Petri kabına 7 ila 8 mL SFM ekleyin. Her bir Petri kabını odacığın merkezi oluğunun bir yanına yerleştirin ve her bir kaba bir elektrot yerleştirin.

Elektriksel sürekliliği sağlamak için hazne ile Petri kapları arasındaki boşluğu doldurun. Agros jel köprülerini kullanarak elektrotları, elektrik akımını ölçmek için seri bağlı bir M metre içeren harici bir güç kaynağına bağlayın ve güç kaynağını açın. Merkezi oluğun hemen karşısındaki elektrik alan şiddetini ölçmek için bir vol metre kullanın.

Güç kaynağının çıkışını gerektiği gibi ayarlayın. Şimdi görüntüleme sistemindeki zaman atlamalı (time-lapse) modülü başlatın. Axio vision yazılımında çok boyutlu kazanımı (multidimensional acquisition) seçin ve "see" butonuna tıklayın.

Kanallar için altıncı kanalı seçin ve zaman atlamalı çekim için T'ye tıklayın. Zaman atlamalı çekim aralığı ayarlarını bir dakika olarak belirleyin, süre ayarlarını "önce" (before) ve "sonra" (after) zaman noktası alanlarında sekiz saat olarak ayarlayın, ardından önceki ve sonraki zaman noktasını seçin. Şimdi başlat'a tıklayın ve deneyin istenilen süre boyunca çalışmasına izin verin; analiz tamamlandıktan sonra IHC analizine geçin.

Kinematik analiz, 250 milivolt/milimetre DCEF varlığında, farklılaşmamış NPC'lerin bu alan şiddetinde katoda doğru oldukça yönlü ve hızlı bir galvanaksis sergilediğini ortaya koymuştur; farklılaşmamış NPC'lerin %98'inden fazlası, görüntülendikleri altı ila sekiz saatlik sürenin tamamı boyunca göç etmiştir. A-D-C-E-F yokluğunda ise hücrelerin rastgele hareket ettiği gözlemlenmiştir.

Ölü hücreler göç etmediği için, bu durum onların bu süre boyunca canlı kaldıklarını göstermektedir. A-D-C-E-F'nin yokluğunda veya varlığında, diferansiye hücrelerin A-D-C-E-F alt kümelerinin hem varlığında hem de yokluğunda, diferansiye fenotipler ihmal edilebilir düzeyde göç göstermiştir. DCEF yönüne dik olarak hizalanma eğiliminde olan uzatılmış çıkımlar görülmüş, ancak belirgin bir hücre gövdesi translokasyonu gözlemlenmemiştir.

İmmünboyama, NPC'lerin altı saatlik DC EF maruziyetinden sonra nöral öncül belirteci nestin'in pozitif ekspresyonunu koruduğunu doğrulamıştır. Olgun fenotiplere farklılaşmaya teşvik edilen NPC'lerin dahil olduğu analizlerde, hücrelerin çoğunluğu altı saatlik DCEF maruziyetinden sonra olgun astrosit belirteci glial fibriler asidik protein veya GFAP eksprese etmektedir. Bu prosedürün ardından, genetik nakavt modelleri kullanılarak doğru akım elektrik alanının hücre hareketliliğine dönüştürülmesinde yer alan hücresel mekanizmalara dair bilgiler edinilebilir.

Veya efendim, örneğin.