Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Bu prosedürün genel amacı, nöral krist hücrelerinin migrasyonunu ve kaderini izlemek amacıyla, bir sülün embriyosundan alınan dorsal nöral tüp eksplantını, gelişim evresi uyumlu bir tavuk embriyosuna nakletmektir. Bu işlem, öncelikle nöral tübe erişmek için konakçı tavuk embriyosunun IGN membranında küçük bir delik açılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, donör sülün embriyosu, greft eksizyonuna hazırlamak için yumurtasından çıkarılır.

Bir sonraki adımda, ilgi bölgesi konakçı embriyonun nöral tüpünden eksize edilir. Ardından, greftleme için donör nöral tüpten benzer bir bölge eksize edilir. Sonrasında, donör nöral tüp konakçı nöral tüpe nakledilir.

Son olarak, seçilen organdaki nöral kriste varan hücrelerin tespiti için kimera embriyo istenen evreye kadar inkübe edilir. Nihayetinde, donör kaynaklı nöral krist hücrelerinin konak embriyodaki çeşitli konumlara göçü ve farklılaşması, immunofloresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir çünkü mikrodisseksiyon ve greftleme adımları çok hassas motor beceriler gerektirmekte ve bu da öğrenilmelerini zorlaştırmaktadır.

Civciv yumurtalarındaki tüm kalıntıların ılık suyla yıkanmasıyla başlayın. Yumurtaları bir tepsi üzerine yatay olarak dizin ve ardından embriyonun konumlanacağı bölgeyi belirtmek için üstte kalan kısımları kurşun kalemle işaretleyin. Donör embriyoların X ovo hazırlığı için, bıldırcın bacaklarını küt tarafı aşağı gelecek şekilde inkübe edin.

Sıradaki adımda, yumurtaları 38 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin ve sallama fonksiyonunu açın. Yumurtaların inkübasyonu tamamlandıktan sonra, üst kısımlarını %70 etanol püskürterek ve ardından bir Kimwipe ile hızlıca silerek sterilize edin. Yumurta kabuğu aracılığıyla herhangi bir emilimi önlemek için, sterilize edilen her bir yumurtayı, burada görülen katlanmış Kimwipe'lar ile döşenmiş Petri kabına benzer şekilde, ayrı bir yumurta tutucuya yerleştirin. Ardından, sterilize edilmiş AA pens kullanarak, yumurtanın sivri ucundaki kabuk yüzeyine küçük bir delik açın.

Beş mililitrelik bir şırıngayı 18,5 gauge'lik bir hipodermik iğne ile donatın. Ardından, iğnenin eğimli ucu yumurtanın sivri ucuna bakacak şekilde, iğneyi yumurta kabuğundaki deliğe dikey olarak yerleştirin. Vakum yoluyla yumurta sarısının yanlışlıkla zarar görmesini önlemek için, deliği daha önce yapıldığı gibi %70 etanol ile temizleyin ve deliği şeffaf yapışkan bantla kapatın.

Ardından, çift A pensi ile yatay bacağın işaretlenmiş üst yüzeyine, tam tepe noktasına gelmeyecek şekilde bir delik daha açın. Sonra, kavisli iris pensinin bir ucunu yumurtaya paralel olacak şekilde deliğe yerleştirin. Daha sonra kabuğu aşağı doğru sıkarak dairesel bir hareketle ilerleyin.

Tavuk yumurtasında iki santimetre çapında bir pencere açın ve çıkarılan yumurta kabuğunu atın. Embriyo, sarısının üzerinde opak bir disk şeklinde görünmelidir. Yumurta sarısının yüzeyinde küçük beyaz bir leke ile belirlenen veya blastodermin bulunmadığı döllenmemiş yumurtaları ayırın.

Şimdi, uygun göz koruyucu ekipman takılıyken, 26,5 gauge'lik bir hipodermik iğneyi iğnenin tabanından başlayarak 45 derecelik bir açıyla bükün. Bükülmüş iğneyi, eğimli tarafı yukarı gelecek şekilde bir mililitrelik bir şırıngaya taktıktan sonra, iğneyi seyreltilmiş Çin mürekkebi ile doldurun. Vitellüs membranını, blaster çevresinin dışından delin ve iğnenin ucunu, vitellüs yüzeyine yakın ancak embriyonik tabakaların içinde olmayacak şekilde embriyonun altına kaydırın.

Ardından, embriyoyu çevreleyecek kadar mürekkep enjekte edin ve hava kabarcığı enjekte etmekten kaçının. İğneyi dikkatlice geri çekin. Şimdi, bir stereo mikroskop ve burada gösterilen fiber optik esnek boyunlu lamba gibi düşük ısı yüküne sahip bir ışık kaynağı kullanın.

Embriyoları hamburger ve Hamilton'a göre evreleyin. Evreyi yumurta kabuklarının üzerine kaydedin. Ardından,dehidrasyonu ve kontaminasyonu önlemek için embriyoların yüzeyine iki ila üç damla sıcak steril ringer çözeltisi uygulayın.

Ardından, pencereleri geçici olarak kapatmak için yumurtaların yüzeyini parafilm ile gererek örtün. Sonra, bıldırcın yumurtalarını transplantasyon için hazırlayın. Yumurtaları inkübatörden çıkarmadan önce, bir Petri kabını ringer solüsyonu ile doldurun.

Ardından, embriyoyu açığa çıkarmak için eğri pens ile yumurtaları küt tarafından açın. Diseksiyon makası kullanarak, embriyonun dışındaki villi membranı ve blastoderm üzerinden, tüm kesiklerin birleştiğinden emin olarak kare şeklinde dört kesik yapın. Sonra, eğri iris pensi kullanarak kesilmiş bir kenarı nazikçe tutun, embriyoyu yumurtadan kaldırın ve hazırlanan petri kabına aktarın.

Son olarak, vitelline membranını 5 numaralı pensle nazikçe kaldırın ve ardından embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında evreleyin. Konak civciv embriyosundaki parafilm tabakasını çıkarın. Daha sonra, sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanarak nöral tüpün istenen bölgesindeki vitelline membranında küçük bir delik açın.

Embriyo üzerine bir damla ringer solüsyonu ekleyin. Ardından, bu videoda gerçekleştirilen gibi tek taraflı greftler için, çekilmiş bir cam iğne kullanarak nöral tüpün orta beyin bölgesine, lümen boyunca ilerlemeyecek şekilde dikkatlice transvers rostral ve kordal insizyonlar yapın. Daha sonra, dorsal nöral tüp ile paryetal mezoderm arasını bilateral olarak kesin.

Son olarak, eksize edilen X explanını nöral tüpten dikkatlice ayırın ve ardından bir cam mikro pipete aspire ederek embriyodan çıkarın. İlk olarak, evre uyumlu bir sülün embriyosu kullanın. Ardından, az önce gösterildiği gibi benzer büyüklükte bir nöral tüp bölgesini eksize edin ve donör X explanını Ringer çözeltisi içeren bir cam mikro pipete aspire edin.

X explanını civciv konakçısının eksize edilen bölgesinin yanına transfer edin. Ardından, çekilmiş bir cam iğne kullanarak ex explanını nazikçe ablate edilen bölgeye yönlendirin. Dehidratasyonu önlemek için embriyoya dikkatlice birkaç damla ringer solüsyonu ekleyin.

Son olarak, pencerenin tüm bölgesini kapattığınızdan emin olarak pencereyi paketleme bandıyla mühürleyin ve yumurtayı istenen evreye gelene kadar inkübatöre geri yerleştirin; kyira inkübasyonu sırasında sallama fonksiyonunu kapatın, canlılığı artırmak için X günde iki kez elle hafifçe çevrilebilir. Gelişimin daha sonraki evreleri hedefleniyorsa, HH 11 evresine kadar altı saatlik yeniden inkübasyon sonrası nöral tüpün greftlenen bölgesine ait bu temsili görüntü, greftlenen sülün donör dokusunun konak civciv nöral tüpüne beklenen entegrasyonunu göstermektedir. HH 11 evresinde greftlenen bölgeden alınan bu enine kesit, hnk ile işaretlenmiş nöral krista hücrelerini ve bunlardan birinin nöral tüpten lateral olarak göç ettiğini göstermektedir.

Nöral krist hücresi göç akımına ve nöral tüpe katkıda bulunan bıldırcın hücreleri, QCPN ile net bir şekilde işaretlenmiştir. Daha sonraki evrelerde, bıldırcın nöral krist hücresi kaynaklı hücrelerin nihai hedef dokularına kadar izleri sürülebilir. Bu şekildeten görülebileceği üzere, QCPN ile işaretlenmiş hücreler, civciv embriyosunun maksiller çıkıntısının meen chi kısmına dağılmış durumdadır. E5 evresinde, bıldırcın kaynaklı nöral krist hücrelerinin farklılaşmasını incelemek için QCPN antikoru diğer antikorlarla kolayca kombine edilebilir.

Konak ortamında. Burada görüldüğü üzere, bıldırcın nöral krist hücrelerinden türetilen trigeminal duyusal nöronlar QCPN ve T UJ one antikorları ile işaretlenmiştir. Bu prosedürün ardından, nöral krist hücrelerinin hangi dokuları oluşturduğu ve çeşitli dokulara farklılaşırken hangi genleri eksprese ettiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla immünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.