Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

Bu prosedürün amacı, A ICD olarak da bilinen amiloid öncül protein hücre içi domainini saflaştırmak ve A ICD'nin termal agregasyonu ile atom kuvvet mikroskobu ile karakterizasyonu için bir protokol sunmaktır. Bu işlem, öncelikle A ICD'nin A GST füzyonunun bakterilerde eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, G-S-T-A-I-C-D proteini saflaştırılır ve GST'yi A ICD'den ayırmak için trombin ile kesilir ve GST uzaklaştırılır.

Ardından A ICD'nin termal agregasyonu tetiklenir. Son olarak, A ICD agregatları atomik kuvvet mikroskopisi kullanılarak görüntülenir. Nihayetinde, A ICD'nin biyokimyasal ve biyofiziksel analiz için yeterli miktarda homojen şekilde saflaştırılabildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, karmaşık kromatografi adımları gerektiren mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça saf ve çözünür bir ICD'nin standart reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak laboratuvar tezgahında izole edilebilmesidir. Bu protokol ile üretilen bir ICD, daha ileri biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyon için uygundur.

Prosedürü Amina ti uygulamalı olarak gösterecektir. Laboratuvarımın eski doktora sonrası araştırmacısı Dr. Andres Oberer, A ICD'nin atomik kuvvet mikroskobu ile görüntülemesinin nasıl yapılacağını gösterecektir. Rekombinant A PP hücre içi alanı veya A ICD'yi eksprese etmek için; insan A ICD'sinin GST'nin C-terminusuna füzyonlandığı pgx 41 vektörü ile transforme edilmiş BL 21 hücreleri ile başlayın, tek bir koloni ile ampisilin içeren 10 mililitre LB besiyerini inoküle edin ve ertesi sabaha kadar 37 °C'de güçlü çalkalama ile gece boyunca inkübe edin.

Bir litrelik erlenmeyle 400 mililitre LB ampisilin içerisine beş mililitre gece boyu büyütülmüş kültür ekleyin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,4 ile 0,6 arasına ulaşana kadar 37 °C'de kuvvetli çalkalama ile inkübe edin. G-S-T-A-I-C-D ekspresyonunu indüklemek için bu işlem normalde iki ila 2,5 saat sürer.

0,4 millimolar IPTG ekledik ve 37 °C'de, şiddetli çalkalama ile beş saat boyunca inkübe ettik. Hücreleri 4 °C'de, 15 dakika boyunca 6.000 ×g'de santrifüjleyin ve pelletini -80 °C'de saklayın. Lizis tamponunu hazırlayıp bakterileri buza yerleştirdikten sonra, pellete 20 mL tampon ekleyin ve bir pipet kullanarak vorteksleme ile buz üzerinde rotasyon kombinasyonuyla iyice karıştırın.

Resuspendü edilen bakteriyel pelletten geçen resuspendü bakteriyel lizatı, önceden soğutulmuş bir emulsifiyerden veya French press'ten geçirin. 30,000 PSI basınçta lizatı emulsifiyerden ikinci kez geçirin ve lizatı önceden soğutulmuş 50 ml'lik bir tüpe toplayın. Lizatı 15,000 ×g ve 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı ayırın ve önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. 500 mikrolitre %50'lik glutatyon agarose slurry ekleyin. Örnek dönerken dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca döndürün.

İnkübasyon sonrası taze elüsyon tamponu hazırlayın. Lizatı ve süspansiyonu, kaba filtrelere sahip tek kullanımlık beş inçlik polistiren kromatografi kolonuna boşaltın. Kolonu üç mililitre PBS ile beş kez yıkayın.

Kolonun alt kısmını kapatın ve 500 µL oda sıcaklığında elüsyon tamponu ekleyin. Kolonun üst kısmını kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün. İlk elüatı soğutulmuş 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.

Elüsyon işlemini iki kez daha tekrarlayın. Elüatı, 10.000 moleküler ağırlık kesim limitli bir diyaliz membranında, dört litre PBS içinde, dört santigrat derecede gece boyunca diyalize edin. Ertesi gün, ek dört litre PBS karşıtıyla dört santigrat derecede bir saat boyunca diyalize edin.

Proteini diyaliz kasetinden çıkarın ve G-S-T-A-I-C-D verimini belirlemek için bir protein miktar tayini analizi gerçekleştirin. 400 milliliters kültürden yapılan tipik bir saflaştırma işlemi, 20 milligrams'tan fazla saflaştırılmış protein verimi ve 10 to 20 milligrams per milliliter konsantrasyonlar ile sonuçlanacaktır. Proteini 200 microliter'lik alikotlar halinde bölün ve minus 80 degrees Celsius'ta dondurun.

A ICD'yi GST'den serbest bırakmak için, 200 µL saflaştırılmış G-S-T-A-I-C-D'ye, mikrolitre başına bir ünite trombin içeren 20 µL ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 ×g'de santrifüj ederek agregat oluşmuş materyalleri temizleyin. GST ve trombini uzaklaştırmak için süpernatantı önceden soğutulmuş bir mikro tüpe aktarın. Sırasıyla 50 µL %50 glutatyon azalmış slurry ve 50 µL %50 p ve wino zaine azalmış slurry ekleyin.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca rotasyonla inkübe edin. Agro boncukları çöktürmek için kısa süreli santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. GST'yi glutatyon ile dört kez daha ekstrakte edin.

Aros, saflaştırılmış A ICD'nin beş µL'si üzerinde bir protein miktar tayini analizi gerçekleştirir. 400 mL'lik bir kültürden elde edilen tipik verimler, 0,2 ile 0,5 mg/mL konsantrasyonda 50 ile 100 µg arasındadır. Taze hazırlanmış A ICD, PBS içinde 0,1 mg/mL konsantrasyona seyreltildikten sonra, numuneler ısıtmalı bir çalkalayıcıda 43 °C'de 800 RPM'de 48 saat boyunca inkübe edilerek termal agregasyon indüklenmiştir.

Numuneyi deiyonize su ile 20 kat seyreltin ve iki mikrolitre miktarında taze olarak koparılmış mika yüzeye damlatın. Agregat oluşturmuş A ICD'leri görüntülemek için numuneyi bir desikatörde gece boyunca kurutun. Nominal uç yarıçapı iki nanometre olan, altın kaplı mikrokristal nitrür kantaleyler kullanarak vurma modunda atom kuvvet mikroskopisi uygulayın.

Görüntüleme sırasındaki tipik vurma genlikleri, konsolların rezonans frekansında 10 ila 20 nanometredir. G-S-T-A-I-C-D'nin ekspresyonu ve göreceli zenginleşmesi burada gösterilmiştir. Lizisten sonra, füzyon proteininin çoğunluğu çözünür fraksiyonda bulunur ve bu nedenle inklüzyon cisimlerinden ekstraksiyon gerekmez.

Glutatyon afinite kolonundan elüye edilen materyal %95'ten daha safdır. Burada gösterilen hazırlıkta, kolondan elüye edilen protein konsantrasyonu 14,5 mg/mL ve verim 22 mg idi. Bu hazırlıktan 200 µL'nin 20 ünite trombin ile gece boyunca inkübe edilmesi, füzyon proteininin neredeyse %100 oranında kesilmesiyle sonuçlanmıştır.

Kullanılan trombin miktarı, Coomassie ile saptanamayacak kadar düşüktür. Mavi boyama, trombin ve GST'nin uzaklaştırılması sonucunda bir miktar materyal kaybı gerçekleşmiştir. Bununla birlikte, bu hazırlıkta verim 0,35 mg/mL konsantrasyonda 70 µg A ICD olup saflık %90'ın üzerindedir.

FM ile görüntülenen ICD agregatları tipik olarak steroid amorf yapılıdır ve boyutları 50 ile 100 nanometre arasında değişir. Agregasyon reaksiyonuna ekimolar miktarda şaperon UBI Quillin one eklendiğinde agrege materyal tespit edilemez. Bu videoyu izledikten sonra, EICD'nin nasıl saflaştırılacağı, agregasyonu nasıl indükleneceği ve A-F-M-E-I-C-D agregatlarının nasıl görüntüleneceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu teknikle saflaştırılan örnekler, moleküler şaperonların EACD agregasyonu üzerindeki etkisine dair soruları yanıtlamak amacıyla ışık saçılması ve filtre tuzağı analizleri gibi diğer yöntemlere uygulanabilir.